向日葵蜂花粉中酚胺類化合物定性定量分析

馮洲旭，張根生，孔令杰，喬江濤，肖興英，張紅城*

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150010；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093）

蜂花粉是工蜂采集植物雄蕊花藥或植物小孢子囊內(nèi)的花粉，加上自己特殊的腺體分泌物、唾液和花蜜初步加工而成的花粉球，呈淡黃色或綠色，味微甜、微苦[1]。向日葵蜂花粉為菊科向日葵屬植物向日葵（Helianthus annuus L.）的蜂花粉粉末[2]，是我國(guó)蜂花粉大宗交易品之一[3]。向日葵蜂花粉具有提高免疫力、抗衰老及美容養(yǎng)顏等作用[4]，其中主要含有氨基酸、脂類、礦物質(zhì)、類胡蘿卜素[5]、植物甾醇[6]、類黃酮[7]、酚酸衍生物[8]及酚胺類化合物等。其中，酚胺類化合物是一類結(jié)構(gòu)上由酚?；c多胺或脫胺芳香族氨基酸偶聯(lián)而成的植物次生代謝產(chǎn)物[9]。酚胺在植物中廣泛存在，是植物生殖器官和種子中的主要酚類成分，并作為代謝中間或終產(chǎn)物在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抵御環(huán)境傷害方面發(fā)揮著重要功能作用[10]。目前，對(duì)蜂花粉中酚胺類物質(zhì)開展的研究相對(duì)較少，對(duì)向日葵蜂花粉中酚胺類化合物成分解析尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用高效液相色譜四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight-mass spectrometry，HPLC-Q/TOF-MS）法，對(duì)向日葵蜂花粉中的8 種酚胺類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定并進(jìn)行定量分析，同時(shí)比較不同產(chǎn)地向日葵蜂花粉中酚胺類化合物的含量差異，以期為酚胺類成分的生物學(xué)活性及藥理學(xué)作用研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

向日葵（Helianthus annuus L.）蜂花粉：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所提供，采集地分別為內(nèi)蒙古（5 個(gè)）、黑龍江（5 個(gè)）和寧夏（5 個(gè)）。蜂花粉樣品采集后于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

無(wú)水乙醇（分析純）：北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司；甲醇（色譜純）、乙酸（色譜純）、乙酸（質(zhì)譜純）：美國(guó)Fisher 公司；三-對(duì)-香豆酰亞精胺、四-對(duì)-香豆酰精胺：哈爾濱商業(yè)大學(xué)蜂產(chǎn)品加工與功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室自制；所有試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-6AD 型高效液相色譜儀：日本島津公司；6520型四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent 公司；BSA124S-CW 型分析天平：德國(guó)Sartorrius 公司；Merk超純水系統(tǒng)、0.22 μm 微孔濾膜：美國(guó)Merk Millipore 公司；Finnpipette F1 單道移液器：美國(guó)Thermo Scientific公司；JECHERS 自動(dòng)樣品制備系統(tǒng)：中國(guó)上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；Thermo Sorvall Biofuge Startos 型臺(tái)式離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher 公司；2 mL 無(wú)菌注射器：中國(guó)江蘇正康醫(yī)療器械有限公司；JC-QXS-4.5L 型數(shù)控超聲波清洗器：中國(guó)昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蜂花粉樣品前處理

準(zhǔn)確稱取3g 向日葵蜂花粉置于樣品管中，用75%乙醇溶解并定容至30 mL。樣品管中加入轉(zhuǎn)子后放入自動(dòng)樣品制備系統(tǒng)，于頻率60 Hz 條件下運(yùn)行120 s。后取出轉(zhuǎn)子，蜂花粉懸濁液在5 000 r/min 條件下離心10 min，以除去蜂花粉懸濁液中的固體不溶物。將離心后的上清液倒入試管中，從試管中吸取2 mL 上清液，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾后，用于HPLC 分析。

1.3.2 色譜/質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Phenomenex Gemini C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A 為水（含0.2%乙酸），流動(dòng)相B 為甲醇（含0.2%乙酸）；梯度洗脫程序?yàn)?～10 min，5%～20%B；10 min～25 min，20%～24%B；25 min～45 min，24%～30%B；45 min～50 min，30%～38%B；50 min～60 min，38%～40%B；60 min～70 min，40%～42%B；70 min～80 min，42%～44%B；80 min～90 min，44%～46%B；90 min～100 min，46%～48%B；100 min～110 min，48%～50%B；110 min～120 min，50%～52%B；120 min ～130 min，52%～54% B；130 min ～140 min，54%～56%B；140 min～150 min，56%～58%B；總流速為0.7 mL/min；柱溫箱溫度為36 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

質(zhì)譜條件：電離源為電噴霧離子化（electron spray ionization，ESI）；檢測(cè)模式為正離子掃描；加熱溫度為350 ℃；離子源噴出電壓為4 kV；出口電壓為130 V；氮?dú)饬魉贋?1 L/min；碰撞氣體為氦氣。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

稱取一定質(zhì)量的反，反，反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺（液相法制備，純度≥95%）、反，反，反，反-四-對(duì)-香豆酰精胺（液相法制備，純度≥95%）于10 mL 容量瓶中，加入75%甲醇溶解配制成10 mL 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

2 結(jié)果與分析

2.1 向日葵蜂花粉中酚胺類化合物的定性分析

向日葵蜂花粉的HPLC 圖如圖1 所示。

圖1 向日葵蜂花粉的高效液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of sunflower bee pollen sample

分離并檢測(cè)出向日葵蜂花粉中所含有的8 種酚胺類化合物，這8 種化合物的名稱、相對(duì)保留時(shí)間、紫外光譜最大吸收波長(zhǎng)（λmax）、分子量及質(zhì)譜有關(guān)信息詳見表1。

化合物1、2、3、5 相對(duì)分子質(zhì)量相同，均為583Da，4 個(gè)峰二級(jí)質(zhì)譜斷裂相同，見圖2。

準(zhǔn)分子離子碎片峰584 m/z[M+H]+在斷裂1 個(gè)香豆酰碎片后，產(chǎn)生分子離子碎片峰438 m/z[M+H]+，而后繼續(xù)斷裂1 個(gè)香豆酰碎片產(chǎn)生分子離子碎片峰292 m/z[M+H]+，第3 次斷裂1 個(gè)香豆酰碎片產(chǎn)生分子離子碎片峰146 m/z[M+H]+，最終相對(duì)分子質(zhì)量145 Da即為亞精胺相對(duì)分子質(zhì)量。由于反式香豆酰屬于平面型結(jié)構(gòu)，雙鍵與處于同一平面的苯環(huán)容易形成π-π 共軛。對(duì)于順式香豆酰，由于空間位阻，造成雙鍵與苯環(huán)處于非平面，不易發(fā)生共軛，故而順式與反式的紫外最大吸收波長(zhǎng)略有不同[11]。所以與順式相比，反式的最大吸收波長(zhǎng)位于長(zhǎng)波端?；衔?、2、3、5 的最大吸收波長(zhǎng)分別是270、280、290、298 nm，分別對(duì)應(yīng)順，順，順-三-對(duì)-香豆酰亞精胺、順，順，反-三-對(duì)-香豆酰亞

精胺、反，順，反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺和反，反，反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺。另外，順式異構(gòu)體是兩個(gè)電負(fù)性相同的原子或原子團(tuán)處在分子的同側(cè)，造成偶極矩的疊加，增加不對(duì)稱性，而不像反式那樣比較對(duì)稱地排列，因而順式分子的偶極距比反式大，為偶極分子，有較弱的極性。因此順式出峰時(shí)間早于反式，化合物1、2、3、5 分別對(duì)應(yīng)順，順，順-三-對(duì)-香豆酰亞精胺、順，順，反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺、反，順，反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺和反，反，反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺。李石飛等[12-14]和LI W C 等[15]運(yùn)用不同的檢測(cè)方法在紅花中鑒定出4 種亞精胺成分并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，經(jīng)過(guò)比對(duì)，向日葵蜂花粉中的4 種亞精胺成分與紅花中4 種亞精胺成分吻合。因此，將化合物1、2、3、5 分別鑒定為順，順，順-三-對(duì)-香豆酰亞精胺、順，順，反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺、反，順，反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺、反，反，反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺，其分子結(jié)構(gòu)如圖3 所示?；衔?、6、7、8 相對(duì)分子質(zhì)量相同，均為786 Da，4 個(gè)峰二級(jí)質(zhì)譜斷裂相同，見圖4。

表1 向日葵蜂花粉酚胺類化合物HPLC-Q/TOF-MS 分析結(jié)果Table 1 Analysis results of phenolamides in sunflower bee pollen by HPLC-Q/TOF-MS

圖2 化合物1、2、3、5 的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 Primary and secondary mass spectra of compounds 1，2，3 and 5

圖3 鑒定的三-對(duì)-香豆酰亞精胺化合物分子結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Molecular structures of tri-p-coumaroylspermidines identified

圖4 化合物4、6、7、8 的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 Primary and secondary mass spectra of compounds 4，6，7 and 8

準(zhǔn)分子離子碎片峰787 m/z[M+H]+在斷裂第1 個(gè)香豆酰碎片后產(chǎn)生分子離子碎片峰641 m/z[M+H]+，而后繼續(xù)斷裂第2 個(gè)香豆酰碎片產(chǎn)生分子離子碎片峰495 m/z[M+H]+，第3 次斷裂1個(gè)香豆酰碎片產(chǎn)生分子離子碎片峰349 m/z[M+H]+，第4個(gè)分子離子碎片204 m/z[M+H]+為1 個(gè)香豆酰與3 個(gè)烷基的組合斷裂。

圖5 鑒定的四-對(duì)-香豆酰精胺化合物分子結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Molecular structures of tetra-p-coumaroylspermines identified

鑒于目前尚未有關(guān)于四-對(duì)-香豆酰精胺的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，故而依據(jù)上述分子量為583 Da 的三-對(duì)-香豆酰亞精胺的結(jié)構(gòu)推導(dǎo)過(guò)程，對(duì)分子量為786 Da 的四-對(duì)-香豆酰精胺進(jìn)行合理推測(cè)，化合物4、6、7、8 分別為順，順，順，順-四-對(duì)-香豆酰精胺、反，順，順，反-四-對(duì)-香豆酰精胺、反，反，順，反-四-對(duì)-香豆酰精胺、反，反，反，反-四-對(duì)-香豆酰精胺，其分子結(jié)構(gòu)如圖5所示。

2.2 向日葵蜂花粉中酚胺類化合物的定量分析

將反，反，反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺、反，反，反，反-四-對(duì)-香豆酰精胺標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液以5、10、15、20、25 μL 進(jìn)樣量進(jìn)行HPLC 色譜分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，上樣量（mg）為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。通過(guò)外標(biāo)法測(cè)定不同產(chǎn)地向日葵蜂花粉中8 種酚胺類化合物的含量（詳見表3）。其中，順，順，順-三-對(duì)-香豆酰亞精胺、順，順，反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺、反，順，反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺含量以反，反，反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺計(jì)；順，順，順，順-四-對(duì)-香豆酰精胺、反，順，順，反-四-對(duì)-香豆酰精胺、反，反，順，反-四-對(duì)-香豆酰精胺含量以反，反，反，反-四-對(duì)-香豆酰精胺計(jì)。

由表3 可知，采收自3 個(gè)不同產(chǎn)地的向日葵蜂花粉中都含有上述8 種酚胺類成分，但其含量具有一定的差異性。4 種三-對(duì)-香豆酰亞精胺的總含量以黑龍江最高為21.88 mg/g，其次是內(nèi)蒙古為19.13 mg/g，寧夏最少為11.61 mg/g。在4 種三-對(duì)-香豆酰亞精胺中，以反，反，反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺的含量最高，其含量分別為內(nèi)蒙古8.37 mg/g、黑龍江9.16 mg/g、寧夏5.67 mg/g。4 種四-對(duì)-香豆酰精胺的總含量以內(nèi)蒙古最高為7.2 mg/g，其次是黑龍江為4.4 mg/g，寧夏最少為4.3 mg/g。在4 種四-對(duì)-香豆酰精胺中，以反，反，反，反-四-對(duì)-香豆酰精胺的含量最高，其含量分別為內(nèi)蒙古2.76 mg/g、黑龍江1.98 mg/g、寧夏1.95 mg/g。結(jié)果顯示，3 個(gè)產(chǎn)地的向日葵蜂花粉中反，反，反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺和反，反，反，反-四-對(duì)-香豆酰精胺的含量均高于其另外3 種異構(gòu)體形式化合物含量，這可能與其化學(xué)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 The linear regression equations and correlation coefficient sof standard compounds

表3 不同產(chǎn)地向日葵蜂花粉中8 種酚胺類化合物含量Table 3 Contents of eight phenolamine compounds in sunflower bee pollens from different province

3 結(jié)論

本研究采用HPLC-QTOF-MS 法共鑒定出向日葵蜂花粉中存在的8 種酚胺類化合物，包括4 種三-對(duì)-香豆酰亞精胺和4 種四-對(duì)-香豆酰精胺。這是首次在向日葵蜂花粉中鑒定出這8 種酚胺類化合物。這些酚胺類化合物是一種帶正電荷的小分子[16]，不僅存在于蜂花粉中，在大米[17]和一些中藥材[18-20]中也有發(fā)現(xiàn)。酚胺類化合物有多種生物功能，例如在人體中，酚胺類化合物水平會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而下降，內(nèi)源性亞精胺濃度的降低和衰老之間可能存在聯(lián)系[21]。最近的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，增加多胺水平，包括提高膳食攝入量，通過(guò)誘導(dǎo)自噬機(jī)制延緩了衰老。酚胺類化合物，被看作“抗衰老維生素”[22]。此外，定量分析結(jié)果還為后期酚胺類成分的生物學(xué)活性及其藥理學(xué)作用的研究提供了基礎(chǔ)。