MIP-3α、CCR6表達(dá)預(yù)測小細(xì)胞肺癌患者胸腔鏡肺癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的價值

陳海全，李曉燕，馬治欣

(平頂山市第二人民醫(yī)院心胸外科，河南 平頂山 467000)

肺癌目前為全世界癌癥死因的首位，約占所有惡性腫瘤的19%[1]，其中小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)占肺癌的15%～20%，屬于惡性程度極高的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，老年人多發(fā)，男性多于女性[2]，具有對初始化療敏感、轉(zhuǎn)速增長、早期轉(zhuǎn)移等特點[3]。有研究[4-5]報道，大多數(shù)SCLC患者發(fā)生轉(zhuǎn)移后才被確診，這時SCLC已處于廣泛期，已錯過最佳治療時期，這也是SCLC的生存率較低的原因之一。因此SCLC的早期治療尤其重要。近年來臨床上對于SCLC的治療很少采用手術(shù)方式，主要以化療和放療為主，雖然SCLC對化療和放療的敏感性高，早期初治改善癥狀效果顯著，但預(yù)后較差。隨著微創(chuàng)外科的快速發(fā)展，胸腔鏡在肺癌治療中的應(yīng)用逐漸成熟起來[6]。但研究[7]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)胸腔鏡肺癌根治后的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的情況較多，腫瘤復(fù)發(fā)是影響患者預(yù)后的主要因素。巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)、趨化因子C-C-基元受體6(CCR6)與細(xì)胞的增殖、生長、遷移等有關(guān)，通過檢測血清中的MIP-3α、CCR6水平變化可以預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。本研究探討SCLC患者M(jìn)IP-3α、CCR6的表達(dá)在預(yù)測胸腔鏡肺癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的臨床價值，報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2017年2月—2020年2月在平頂山市第二人民醫(yī)院診治的SCLC患者160例，根據(jù)術(shù)后是否發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移分為轉(zhuǎn)移組(n=70)和非轉(zhuǎn)移組(n=90)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床TNM分期明確。②均采用胸腔鏡肺癌根治術(shù)。③隨訪2 a。④臨床資料完整者。⑤經(jīng)臨床、影像及手術(shù)病理確診為SCLC。排除標(biāo)準(zhǔn)：①精神障礙，無法自主配合研究者。②合并其他惡性腫瘤者。③重要臟器功能嚴(yán)重障礙者。2組患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙史、腫瘤大小比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 ①血清標(biāo)本采集及檢測方法：于SCLC患者手術(shù)前及手術(shù)后30 d采集2組患者的晨起空腹外周靜脈血，靜置20 min，3 000 r·min-1離心10 min，取上層血清，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測MIP-3α、CCR6水平。②SCLC組織MIP-3α、CCR6免疫組織化學(xué)染色：所有組織用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片脫蠟、水化、熱修復(fù)；3%H2O2去離子水孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化酶，PBS沖洗2 min×3次；加入一抗，4 ℃過夜，PBS沖洗2 min×3次；加入二抗，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、樹膠封固。PBS替代一抗作陰性對照。③實時熒光定量PCR檢測：引物使用Primers軟件，PCR熱循環(huán)參數(shù)：90 ℃5 min；3步反應(yīng)：95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)，于72 ℃ 30 s收集熒光信號。擴增完畢后，以GADPH為內(nèi)參，得到MIP-3α、CCR6 mRNA表達(dá)量。④蛋白質(zhì)印跡法檢測：測定肺癌組織總蛋白水平，上樣總蛋白總量為50 g，以3%SDS上樣緩沖液定容于等體積，加入5×上樣緩沖液，常溫下SDS-PACE電泳，4 ℃電轉(zhuǎn)至PVDF膜孵育相應(yīng)一抗(1∶200)和二抗(1∶5 000)，然后化學(xué)發(fā)光，X線曝光、顯影、定影。用Quantity One軟件分析圖片，以目的蛋白與內(nèi)參吸光度比值進(jìn)行半?yún)⒘糠治觥?/p>

1.2.2 觀察指標(biāo) ①2組患者血清MIP-3α、CCR6表達(dá)的部位。②2組患者M(jìn)IP-3α、CCR6的表達(dá)情況：通過比較2組MIP-3α、CCR6陽性細(xì)胞率評分及染色強度評分來反映MIP-3α、CCR6的表達(dá)情況。陽性細(xì)胞率：0分：<25%；1分：26%～50%；2分：51%～75%；3分≥76%。陽性細(xì)胞率總評分=(0分患者例數(shù)×0)+(1分患者例數(shù)×1)+(2分患者例數(shù)×2)+(3分患者例數(shù)×3)。染色強度：陰性0分：不著色；弱陽性1分：淡黃色；陽性2分：棕黃色；強陽性3分：棕褐色。染色強度總評分=(陰性0分患者例數(shù)×0)+(弱陽性1分患者例數(shù)×1)+(陽性2分患者例數(shù)×2)+(強陽性3分患者例數(shù)×3)。③2組患者M(jìn)IP-3α、CCR6高表達(dá)率和染色指數(shù)比較,高表達(dá)率定義為50%以上的細(xì)胞染色陽性。染色指數(shù)=染色強度平均值×陽性細(xì)胞率評分。分?jǐn)?shù)在0～9分，每張切片隨機計算5個40倍物鏡視野中細(xì)胞表達(dá)陽性率及染色強度，求出染色指數(shù)，取平均值作為最終結(jié)果。④比較2組MIP-3α、CCR6 mRNA和蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 MIP-3、CCR6在SCLC組織中的表達(dá) MIP-3以免疫組化法染色，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、封片，結(jié)果顯示，其主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。CCR6以免疫組化法染色，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、封片，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。見圖1-2。

2.2 2組MIP-3α、CCR6陽性細(xì)胞率評分及染色強度評分比較 轉(zhuǎn)移組MIP-3α、CCR6陽性腫瘤細(xì)胞總評分分別為132分、122分，非轉(zhuǎn)移組分別為為46分、45分；轉(zhuǎn)移組的MIP-3α、CCR6的染色強度總評分分別為171分、172分，非轉(zhuǎn)移組分別為121分、122分；轉(zhuǎn)移組MIP-3α、CCR6表達(dá)高于非轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2-3。

圖1 SCLC組織中MIP-3的表達(dá)情況(HE×100)

圖2 SCLC組織中CCR6的表達(dá)情況(HE×100)

表2 2組MIP-3α、CCR6陽性細(xì)胞率評分比較

表3 2組MIP-3α、CCR6染色強度評分比較

2.3 2組MIP-3α、CCR6高表達(dá)率和染色指數(shù)比較 轉(zhuǎn)移組MIP-3α、CCR6高表達(dá)率和染色指數(shù)高于非轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組MIP-3α、CCR6高表達(dá)率和染色指數(shù)比較

2.4 2組MIP-3α、CCR6 mRNA和蛋白表達(dá)比較 轉(zhuǎn)移組MIP-3α、CCR6mRNA和蛋白表達(dá)高于非轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 2組MIP-3α、CCR6 mRNA和蛋白表達(dá)比較

3 討論

肺癌的發(fā)病率和病死率均較高。據(jù)統(tǒng)計，2010年美國新增肺癌病例為222 000例，其中157 000例患者死亡[8]。肺癌分為SCLC與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，兩種類型的發(fā)病率、病理學(xué)類型、預(yù)后、生物學(xué)行為及對治療的反應(yīng)均存在較大差異[9]。其中，SCLC腫瘤細(xì)胞增加時間短、進(jìn)展快，常伴有內(nèi)分泌異?；蝾惏┚C合征，早期易轉(zhuǎn)移，對放化療敏感，預(yù)后較差[10]。腺癌表現(xiàn)為周圍型實質(zhì)腫塊，早期可侵襲淋巴管、血管，常在原發(fā)癌引起癥狀前轉(zhuǎn)移，易轉(zhuǎn)移至腦、肝及骨，更易累及胸膜引發(fā)胸腔積液[11]。

生長因子構(gòu)成趨化細(xì)胞因子家族，在人身體出現(xiàn)炎癥時會導(dǎo)致全身白細(xì)胞的遷移，參與胚胎發(fā)育、血管生成、自身免疫及腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[12]。MIP-3受體是CCR6，靶細(xì)胞是未成熟樹突狀細(xì)胞和記憶細(xì)胞[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，MIP-3主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，CCR6主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，與張霄鵬等[14]研究相似。既往研究[15]發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤細(xì)胞MIP-3、CCR6表達(dá)增加。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，肝癌患者細(xì)胞表面的CCR6表達(dá)顯著增加。趙海潮等[17]對小鼠肝癌MIP-3的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織由于趨化因子的缺失導(dǎo)致抗原提呈細(xì)胞不足，以引發(fā)腫瘤局部免疫反應(yīng)而導(dǎo)致肝臟局部病變的侵襲及發(fā)展。GUO等[18]研究也顯示，CCR6在惡性腫瘤患者中也會有高表達(dá)現(xiàn)象，CCR6的高表達(dá)與病毒的存活相關(guān)，與疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險相關(guān)，CCR6被認(rèn)為是潛在的新的預(yù)后標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，與非轉(zhuǎn)移組比較，轉(zhuǎn)移組MIP-3、CCR6表達(dá)顯著增加，MIP-3、CCR6mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，經(jīng)胸腔鏡肺癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者血清中MIP-3、CCR6的表達(dá)率較未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者高，且MIP-3、CCR6mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加。MIP-3、CCR6表達(dá)與SCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系。