荔枝葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)及其繼代增殖研究

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，廣東 廣州 510640）

【研究意義】荔枝（Litchi chinensisSonn.）原產(chǎn)于中國，迄今已有2000 多年的栽培歷史，是熱帶及亞熱帶地區(qū)的重要經(jīng)濟作物。我國擁有世界上最豐富的荔枝種質(zhì)資源，但由于童期長、多年生、高度雜合等因素的影響，加上荔枝遺傳背景研究資料的缺乏，導(dǎo)致荔枝常規(guī)育種的進程被限制。荔枝組織培養(yǎng)技術(shù)自20 世紀(jì)80 年代建立以來，已見花藥［1］、幼胚［2］、莖段［3］、原生質(zhì)體［4］、胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化［5］以及胚性細胞懸浮物［6］等作為外植體進行荔枝再生體系研究的報道，這為荔枝遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)育種提供了基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】植物中可誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的外植體種類很多，分化程度較低的外植體在植物生長調(diào)節(jié)劑作用下容易誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，如玉米（Zea maysL.）的幼胚［7］、苜蓿（Medicago sativaL.）的子葉和下胚軸［8］等；而分化程度較高的外植體較難誘導(dǎo)，需進行特殊處理，如需光照條件的刺楸（Kalopanax septemlobusT.）葉片［9］,需0.5 mg/L TDZ 和2.0 mg/L 2,4-D 配合處理的朱頂紅（Hippeastrum vittatumL.）花梗［10］等。研究表明，荔枝組織培養(yǎng)最早是選用花藥［1］作為外植體，該方法具有胚性高、誘導(dǎo)率高等優(yōu)點，但取材困難且受花期限制；花藥誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織染色體變異頻率較幼胚來源的胚性愈傷組織高［11］；通過花藥獲得純合的單倍體再生荔枝植株極其困難［12］。幼胚作為外植體也受取材困難和操作難度高等因素影響。莖段取材方便，但胚性低、僅能誘導(dǎo)出愈傷組織［3］。研究發(fā)現(xiàn)，外源生長素和細胞分裂素的合理搭配在巴西香蕉［13］、番木瓜［14］和小果野蕉［15］胚性愈傷組織的誘導(dǎo)中起決定性作用，2,4-D 對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)影響顯著，單一添加2,4-D 或搭配其他激素對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)有促進作用。另外，添加劑在胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖中也有廣泛應(yīng)用，如青海云杉（Picea crassifoliaK.）愈傷組織增殖過程中添加水解酪蛋白、谷氨酰胺和Phytagel 凝膠［16］，金煌芒果（Mangifera indicaL.）胚性愈傷組織誘導(dǎo)中添加椰子水、谷氨酰胺和活性炭（AC）［17］，杉木胚性愈傷組織誘導(dǎo)中添加茉莉酸甲酯（MeJA）［18］。添加劑在一定程度上可減少組織褐化、促進愈傷組織形成和體胚發(fā)生等［19］。胚性愈傷組織在激素條件下長期繼代培養(yǎng)，其生長速率逐漸降低、生長狀態(tài)下降，最終失去胚性成為非胚性組織塊［20］。謝玉明等［21］研究表明，除去或降低生長素濃度，利于荔枝胚性愈傷組織的增殖和體細胞胚的發(fā)生?！颈狙芯壳腥朦c】目前關(guān)于荔枝胚性愈傷組織誘導(dǎo)及分化研究所選用的材料主要集中在幼胚和花藥，但其花期短、取材困難。葉片作為外植體材料來源較廣、取材方便、操作簡單，可以保持原有品種的優(yōu)良性狀，其應(yīng)用更為廣泛［19］?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究選取荔枝早、中、晚熟幾個代表性品種，以無菌苗葉片為外植體進行胚性愈傷組織誘導(dǎo)，設(shè)計3 種不同繼代培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式進行繼代增殖試驗，對影響葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的植物生長調(diào)節(jié)劑、基因型和接種方式的若干因素進行研究，以期為建立高效的荔枝葉片離體再生體系提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為御金球成年樹體葉片，以及早熟品種三月紅和妃子笑、中熟品種桂味和糯米糍、晚熟品種御金球的無菌苗葉片。所有品種葉片和果實均采自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所果園，無菌苗葉片由該所荔枝栽培與生理研究室培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體選取與消毒 荔枝葉片的取材時間為2018 年4－6 月晴天上午9：00－10：00，取御金球樹體上新抽生1、2、4 周的葉片，放入冰盒中帶回實驗室。將葉片置于流水中緩慢沖洗10～30 min 后，用蒸餾水潤洗1 次。在超凈工作臺上，將葉片用5% Sanosil 消毒液浸泡消毒5 min，無菌水漂洗1 次；1%多菌靈溶液浸泡消毒5 min，無菌水漂洗3 次。

1.2.2 無菌苗培養(yǎng) 取花后10～11 周成熟果，將果實的果皮、果肉及白色軟組織剔除并清洗干凈，將清洗后的種子置于超凈工作臺，用5%Sanosil 消毒液浸泡消毒10 min，無菌水漂洗1次；1%多菌靈溶液浸泡消毒5 min，無菌水漂洗1 次；70%酒精浸泡20～30 s，無菌水漂洗1 次；再放入0.5%升汞溶液中浸泡滅菌10 min，最后用無菌水漂洗3 次。將種子水平接種于WPM 粉（Woody Plant Medium，木本植物用培養(yǎng)基）+Ca（NO3）20.56 g/L+BAP（6-Benzylaminopurine）11 μmol+Kn（Kinetin）2.3 μmol+GA30.6 μmol+蔗 糖30 g/L+CH（Casein hydrolysate）400 mg/L+15% CW（Coconut water）+瓊脂6 g/L 培養(yǎng)基上，置于光照強度1500～2000 lx、溫度25（±1）℃、16 h 光照/8 h 黑暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 d。

1.2.3 葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo) 分別以植物生長調(diào)節(jié)劑和防褐化劑為影響因子進行單因素試驗：（1）以MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)2,4-D、NAA、KT 3 種植物生長調(diào)節(jié)劑組合，同時添加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L、肌醇100 mg/L，探討植物生長調(diào)節(jié)劑對御金球葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響；（2）選取聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、抗壞血酸（Vc）和活性炭（AC）為防褐化劑，每種防褐化劑設(shè)100、500、1000 mg/L 3 個濃度梯度，以不添加防褐化劑作為對照，以期篩選防褐化效果最佳的添加劑及其濃度。每個處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)接種10 瓶，每瓶接種外植體6 枚左右。

選擇健康生長的培養(yǎng)20 d 的三月紅、桂味、糯米糍、妃子笑、御金球的無菌苗，以完全展開的葉片作為外植體，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。將御金球成年樹體上新抽生1、2、4 周的葉片與1、2、4 周的無菌苗葉片（時間均以葉片完全伸展后開始計算）接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，取材樣品見圖1。同樣地，將御金球葉片切割成1 cm2大小，然后以正面朝上、正面朝下、沿主葉脈垂直方向切兩道傷口的前提下葉片正面朝上和正面朝下4 種方式接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以上單因素試驗探索出的最適培養(yǎng)基，探討基因型、外植體來源及時期、不同接種方式對荔枝葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響。每個處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)接種10 瓶，每瓶接種外植體6 枚左右。

圖1 不同來源及時期的荔枝葉片F(xiàn)ig.1 Litchi leaves from different sources and stages

1.2.4 胚性愈傷組織繼代增殖培養(yǎng) 以御金球品種誘導(dǎo)出的葉片胚性愈傷組織為試驗材料，選取外觀黃色或淡黃色、長勢較快的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基上。基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS，均添加有蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L、PVP 500 mg/L，設(shè)計NAA 和6-BA 兩個單因素，濃度均為0.5 mg/L 和2.0 mg/L，以不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑為對照。

設(shè)計3種不同繼代培養(yǎng)基及繼代方式對胚性愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，以研究不同繼代方式對胚性愈傷組織繼代增殖的影響。3種繼代培養(yǎng)基分別為：MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+PVP 500 mg/L（J1）、MS+2,4-D 1.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+PVP 500 mg/L（J2）、植物生長調(diào)節(jié)劑減半的J2培養(yǎng)基并添加2.0 mg/L AgNO3（J3）。3種繼代方式分別為：（1）只用J2培養(yǎng)基進行胚性愈傷組織繼代；（2）J1和J2培養(yǎng)基交替繼代；（3）J2和J3培養(yǎng)基交替繼代。每瓶培養(yǎng)基接種量大致相同，接種完后記錄其鮮重。每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)接種10瓶。

1.2.5 培養(yǎng)條件 愈傷組織/胚性愈傷組織誘導(dǎo)的條件為黑暗培養(yǎng)、溫度25（±1）℃，繼代2 次（培養(yǎng)基不變），繼代周期為20 d，培養(yǎng)60 d 后統(tǒng)計褐化率和誘導(dǎo)率。繼代培養(yǎng)條件為黑暗培養(yǎng)、溫度25（±1）℃，培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計增殖率。胚性愈傷組織的判斷方法為：黃色或淡黃色，結(jié)構(gòu)疏松，無明顯褐化且直徑大于0.5 cm 的愈傷組織。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 進行變量分析，采用Duncan's進行差異顯著性測驗。參數(shù)計算方法如下：

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=產(chǎn)生愈傷組織數(shù)/外植體總數(shù)（污染除外）×100

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=產(chǎn)生胚性愈傷組織數(shù)/外植體總數(shù)（污染除外）×100

褐化率（%）=褐化的外植體數(shù)/外植體總數(shù)（污染除外）×100

增殖率（%）=30 d 后胚性愈傷的鮮重/接種時胚性愈傷鮮重×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基成分對荔枝葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.1.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對荔枝葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響 從表1 可以看出，2,4-D 對荔枝葉片胚性愈傷組織的誘導(dǎo)影響顯著，未添加2,4-D的對照和高濃度（10.0 mg/L）2,4-D 處理均難以誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，1.5 mg/L 2,4-D 處理誘導(dǎo)率相對較高，為御金球葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳濃度。未添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的對照誘導(dǎo)率為0，其葉片材料在初期可誘導(dǎo)出愈傷組織，但幾乎為結(jié)構(gòu)致密、顏色整體偏綠并帶有白點的塊狀組織，在后續(xù)的繼代過程中未能轉(zhuǎn)為胚性愈傷組織。在培養(yǎng)基中添加有2,4-D 的條件下，低劑量NAA 對葉片胚性愈傷的影響不顯著，高劑量（2.0 mg/L）NAA 反而產(chǎn)生抑制作用；相比于單獨添加2,4-D，附加2.0 mg/L KT 對胚性愈傷的誘導(dǎo)有促進作用，其誘導(dǎo)率最高為46.25%。由此可知，本試驗中最適植物生長調(diào)節(jié)劑組合為2,4-D 1.5 mg/L+KT 2.0 mg/L。

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑對御金球葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 1 Effects of plant growth regulators on the induction of embryogenic callus from Yujinqiu leaves

2.1.2 防褐化劑對荔枝葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響 表2 顯示，3 種防褐化劑處理后荔枝葉片褐化率均低于對照，說明外加防褐化劑PVP、Vc、AC 均能在一定程度上抑制外植體褐化。不同防褐化劑效果有顯著差異，其中AC 的防褐化效果最好、1000 mg/L AC 褐化率最低為22.64%，Vc 的防褐化效果最差，不同濃度PVP 和Vc 的防褐化效果無顯著差異。從誘導(dǎo)率來看，低濃度（100 mg/L）PVP 和Vc 與對照組之間沒有顯著差異，不同濃度的Vc 對誘導(dǎo)率的影響也無顯著差異。而不同濃度PVP 和AC 對誘導(dǎo)率的影響顯著，其中PVP 濃度為500 mg/L 時誘導(dǎo)率最高、為45.28%，AC 濃度為1000 mg/L 時誘導(dǎo)率最低、僅4.65%。

表2 防褐化劑對御金球葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of different anti-browning agents on the induction of embryogenic callus from Yujinqiu leaves

2.2 不同基因型對荔枝葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以5 個品種荔枝的無菌苗葉片為試驗材料，培養(yǎng)20 d 后5 個品種外植體均能誘導(dǎo)出愈傷組織，其中三月紅和御金球的誘導(dǎo)效果較好，前者誘導(dǎo)率最高為85.83%；另外3 個品種誘導(dǎo)率較低，最難誘導(dǎo)出愈傷組織的品種為桂味，誘導(dǎo)率僅8.62%（表3）。培養(yǎng)60 d 后，三月紅和御金球能誘導(dǎo)出狀態(tài)較好且可用于后續(xù)試驗的胚性愈傷組織，御金球誘導(dǎo)率最高（42.50%），其誘導(dǎo)過程如圖2A-F；妃子笑誘導(dǎo)率最低（僅3.39%）；桂味和糯米糍未能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。可見，基因型對荔枝葉片愈傷組織和胚性愈傷組織的誘導(dǎo)影響顯著。

表3 不同基因型對荔枝葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of different genotypes on the induction of embryogenic callus from lichi leaves

圖2 御金球荔枝胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程Fig.2 Induction process of embryogenic callus of Yujinqiu

2.3 不同外植體來源、時期和接種方式對荔枝葉片胚性愈傷誘導(dǎo)的影響

從表4 可以看出，不同來源及時期葉片對荔枝胚性愈傷組織誘導(dǎo)影響顯著。成年樹體上葉片無法誘導(dǎo)出胚性愈傷組織（圖2G-I），且外植體褐化率高，其原因可能是接種前的消毒作用使葉片受損嚴(yán)重導(dǎo)致外植體活性下降，或是成年樹體葉片中酚類物質(zhì)代謝旺盛，培養(yǎng)基條件不足以抑制或降低酚類物質(zhì)濃度而導(dǎo)致外植體大量褐化。而2～4 周的無菌苗葉片均能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織（圖2A-F），尤以葉齡2 周的材料誘導(dǎo)率最高（36.44%），這可能與未經(jīng)消毒和酚類物質(zhì)代謝程度低有關(guān)。后期試驗還發(fā)現(xiàn)，隨著苗齡增長，苗齡1 年以上的幼嫩葉片誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的能力越來越弱甚至無法誘導(dǎo)，而成年樹體上不同時期的葉片均無法誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。

4 種不同接種方式對荔枝葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響差異顯著。其中，“正面朝上”接種的外植體誘導(dǎo)率最低、僅為3.70%；將外植體“沿主葉脈垂直方向切開兩道傷口后正面朝下”的接種方式，誘導(dǎo)率最高、為43.40%，這可能是因為當(dāng)葉片“正面朝上”時，葉片僅有葉緣和少量葉面與培養(yǎng)基接觸，而“正面朝下”時有較大葉面積與培養(yǎng)基接觸，即葉片正面與培養(yǎng)基的接觸面積較背面大，將正面朝下貼于培養(yǎng)基表面更利于植物生長調(diào)節(jié)劑對葉片胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。另外，將葉片正面朝下并在葉片上切兩道傷口能顯著提高愈傷的誘導(dǎo)率，說明在不使組織受傷過度死亡的前提下，適當(dāng)增加外植體傷口有助于愈傷的誘導(dǎo)。因此，本試驗中最適合葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)的外植體接種方式為沿主葉脈垂直方向切開兩道傷口后正面朝下接種。

表4 不同外植體來源及時期對御金球葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 4 Effects of different explant sources and durations on the induction of embryogenic callus from Yujinqiu leaves

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對荔枝葉片胚性愈傷組織繼代增殖的影響

以御金球品種誘導(dǎo)出的葉片胚性愈傷組織為實驗材料，利用單因素試驗設(shè)計6個處理和2個對照，胚性愈傷組織的生長狀況和增殖率見表5。表5顯示，不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的增殖率差異顯著，在添加1.5 mg/L 2,4-D的情況下，低濃度6-BA和一定濃度NAA對胚性愈傷增殖有促進作用；在較高濃度6-BA培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)中愈傷組織容易褐化，影響增殖和后續(xù)體細胞胚的誘導(dǎo)。胚性愈傷組織在含有2,4-D 1.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L中增殖率最高、為364%；2,4-D 1.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L處理的增殖率最低、近82%。對比對照可知，胚性愈傷在不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上增殖率較低，其胚性愈傷組織生長良好、無褐化現(xiàn)象，但生長緩慢。因此，本試驗中適合葉片胚性愈傷組織繼代增殖的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為2,4-D 1.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L，其繼代培養(yǎng)過程見圖3。

表5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對御金球葉片胚性愈傷組織繼代增殖的影響Table 5 Effects of different plant growth regulator combinations on subculture proliferation of embryogenic callus from Yujinqiu leaves

3 種繼代培養(yǎng)方式的試驗結(jié)果見表6，從表6 可以看出，只用J2 培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)增殖率最高，但其胚性愈傷組織的生長狀態(tài)較差，繼代過程中有部分組織褐化且有早期體細胞胚產(chǎn)生，胚性愈傷生長的同步性較 差。J1 和J2 培養(yǎng)基交替繼代、J2 和J3 培養(yǎng)基交替繼代兩種方式下胚性愈傷組織生長狀態(tài)無顯著差異，而J2 和J3 培養(yǎng)基交替繼代方式的增殖率相對較高，因此本試驗中適合葉片胚性愈傷組織繼代增殖的方式為MS+2,4-D 1.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+PVP 500 mg/L（J2）和MS+2,4-D 0.75mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+PVP 500 mg/L+AgNO32.0 mg/L（J3）培養(yǎng)基交替繼代。

圖3 御金球胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)過程Fig.3 Subculture process of embryogenic callus of Yujinqiu

表6 不同繼代方式對御金球葉片胚性愈傷組織增殖的影響Table 6 Effects of different subculture ways on proliferation of embryogenic callus from Yujinqiu leaves

3 討論

3.1 胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響因素

胚性愈傷組織培養(yǎng)是體細胞胚發(fā)生間接途徑所必須經(jīng)歷的中間階段，也是成功獲得體細胞胚并進一步培養(yǎng)成再生植株的重要階段［22］。胚性愈傷組織的誘導(dǎo)受多種因素的影響，包括植物生長調(diào)節(jié)劑、基因型、外植體類型、外加添加劑和培養(yǎng)條件等［23］?；蛐妥鳛橐环N主要的內(nèi)在影響因素，對愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代能力和增殖能力影響很大。荔枝胚性愈傷組織的誘導(dǎo)頻率受基因型影響［24］。本試驗以早、中、晚熟5 個代表性荔枝品種為研究對象，其中御金球和三月紅成功誘導(dǎo)出黃色、組織疏松、生長狀態(tài)較好的胚性愈傷組織。

外添不同種類及不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)影響顯著。2,4-D 的添加與否直接影響荔枝胚性愈傷組織能否被誘導(dǎo)［2］。在本研究中，以2,4-D 的常用濃度2～4 mg/L［25］為參考進行預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)1.5 mg/L 2,4-D 對愈傷組織的誘導(dǎo)效果較好。另外，添加2.0 mg/L KT 或0.5 mg/L NAA 有較高的胚性愈傷誘導(dǎo)率；剛誘導(dǎo)的愈傷組織呈淺綠色、半透明水潤狀，此時的愈傷是沒有胚性的愈傷組織。在培養(yǎng)基中約繼代3 代后，顏色為淺黃/黃色疏松顆粒狀胚性愈傷組織從原組織上長出，說明荔枝葉片愈傷組織需進行繼代培養(yǎng)后才能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。

荔枝的組織或器官在離體情況下會產(chǎn)生大量酚類物質(zhì)，使組織褐化壞死。克服荔枝外植體褐化是誘導(dǎo)胚性愈傷組織成功的關(guān)鍵之一［26］。中國李愈傷組織培養(yǎng)中，PVP 的抗氧化能力最強、AC 次之、CA 最差，且同一防褐化劑的不同濃度對褐化影響較大［27］。本研究中，低濃度PVP 和Vc 對荔枝葉片胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和外植體的防褐效果都較小，高濃度AC 雖然防褐化效果最好，但其誘導(dǎo)率也最低，這可能是因為AC 在吸附外植體產(chǎn)生的毒害和酚類物質(zhì)時也吸附2,4-D，從而降低了誘導(dǎo)率。因此，本試驗中最適合葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)的防褐化劑為PVP，最適濃度為500mg/L。

3.2 胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響因素

植物再生體系的關(guān)鍵步驟之一在于體細胞胚的發(fā)生，而胚性愈傷組織的生長同步性是否一致、在培養(yǎng)過程中是否保持較高的胚性和增值率是其能否脫分化成為體細胞胚的關(guān)鍵因素。有研究報道，在胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)過程中，植物生長調(diào)節(jié)劑和添加劑起到至關(guān)重要的作用。將番茄胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA 和2,4-D 的濃度降低到50%以下，其胚性愈傷組織胚性化保持效果最好、生長速度最快［28］。2,4-D 濃度減半并添加有10 mg/L AgNO3的培養(yǎng)基可誘導(dǎo)和保持松散型胚性愈傷組織［29］。在樟樹胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加200 mg/L 水解絡(luò)蛋白和200 mg/L環(huán)糊精可保持胚性愈傷組織增殖和體細胞胚誘導(dǎo)［30］。本研究中，適合荔枝葉片胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為2,4-D 1.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L，并在與該組合減半、添加2.0 mg/L AgNO3的培養(yǎng)基上交替繼代培養(yǎng)保存6 個月，仍具有良好的生長狀態(tài)。這為荔枝再生體系技術(shù)的建立打下了良好基礎(chǔ)，也為后續(xù)試驗提供了優(yōu)質(zhì)的原始材料；本試驗結(jié)果也進一步說明植物生長調(diào)節(jié)劑和添加劑的重要性，并且胚性愈傷組織的繼代培養(yǎng)不是簡單的新舊培養(yǎng)基之間的轉(zhuǎn)移，保持好生長同步性和胚性是繼代培養(yǎng)過程應(yīng)當(dāng)重視的問題。

4 結(jié)論

對荔枝葉片胚性愈傷組織誘導(dǎo)及其繼代培養(yǎng)條件優(yōu)化研究結(jié)果表明，抽芽后20 d 左右的無菌幼葉在2,4-D 1.5 mg/L+KT 2.0 mg/L 組合下，經(jīng)2～3 次繼代后三月紅和御金球品種能誘導(dǎo)出胚性組織；添加500 mg/L PVP 能獲得更多胚性愈傷組織。胚性愈傷組織在含有2,4-D 1.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L 中繼代增殖率最高、達364%；并在上述組合濃度減半、添加2.0 mg/L AgNO3的培養(yǎng)基上交替繼代培養(yǎng)保存時間最長、生長狀態(tài)最好。