毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蔬菜中多抗霉素和丙草胺殘留

趙艷霞，王大紅

（武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430074）

多抗霉素、丙草胺都是廣譜抗生素類生物源農(nóng)藥，是蔬菜種植中常用的抗菌素[1-5]，對(duì)多種真菌性病害具有良好的防治效果。但隨著多抗霉素、丙草胺在蔬菜病蟲害防治上的廣泛應(yīng)用，由其引起的環(huán)境和食品安全問題日益突顯[6-9]，因此研究多抗霉素、丙草胺在蔬菜中的殘留檢測(cè)方法具有十分重要的意義。

目前兩者的分析方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[10-12]、氣相色譜法[13]、高效液相色譜法[14-15]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16-17]等方法。但這些方法存在預(yù)處理繁瑣、耗時(shí)長等缺點(diǎn)。毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光（capillary electrophoresis-electrochemiluminescence，CE-ECL）聯(lián)用技術(shù)因其具有檢出限低、分離速度快、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)[18-20]，逐漸成為農(nóng)藥殘留檢測(cè)高效技術(shù)之一。目前還未見CE-ECL同時(shí)測(cè)定多抗霉素和丙草胺的報(bào)道。本研究嘗試將毛細(xì)管電泳雙重分離機(jī)理與電化學(xué)發(fā)光的特異性優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，開發(fā)蔬菜中多抗霉素和丙草胺殘留同時(shí)檢測(cè)的方法，并對(duì)前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，以期為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)提供有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二氯三聯(lián)吡啶釕（Ru（bpy）32+）（純度98.0%）、多抗霉素（純度99.8%）、丙草胺（純度99.5%）標(biāo)準(zhǔn)品：購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；甲醇（色譜純）：上海麥克林有限公司；實(shí)驗(yàn)用去離子水：由美國Millipore MilLi-Q型超純水機(jī)制得超純水，電阻率＞18.2 MΩ·cm；測(cè)試樣品（青菜、芹菜等）：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

MPI-A型毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)：西安瑞邁公司；Agilent1120型高效液相色譜儀：Agilent公司；API 3500 QTrap高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國AB公司；Trace 1310氣相色譜儀：賽默飛公司；XS204型分析天平：瑞士梅特勒托利多公司；MX1000型渦旋振蕩儀：杭州瑞誠儀器有限公司；TQ20型超聲波儀：無錫寶得瑞有限公司；DL5Y高速離心機(jī)：長沙湘銳離心機(jī)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 檢測(cè)電位對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響

檢測(cè)電位是CE-ECL實(shí)驗(yàn)條件中一個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)參數(shù)[21]，不同的檢測(cè)電位對(duì)兩種目標(biāo)物的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度會(huì)產(chǎn)生不同影響。試驗(yàn)在0.2～1.25 V區(qū)間范圍內(nèi)施加不同正向電位，考察對(duì)兩種目標(biāo)物電化學(xué)發(fā)光曲線強(qiáng)度的影響。

1.3.2 檢測(cè)池條件的優(yōu)化

檢測(cè)池磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）的濃度以及檢測(cè)池緩沖液的pH也是影響電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的重要因素[22]。試驗(yàn)分別考察PBS濃度在20～55 mmol/L和檢測(cè)池緩沖液的pH 6.0～9.5時(shí)，對(duì)兩種目標(biāo)物電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。

影響多抗霉素和丙草胺電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的另一關(guān)鍵參數(shù)是Ru（bpy）32濃度的選擇[23-24]。作為電化學(xué)發(fā)光試劑，Ru（bpy）32濃度影響著電化學(xué)發(fā)光的底值和兩種目標(biāo)物共發(fā)光的強(qiáng)度。較佳的Ru（bpy）32濃度會(huì)增加目標(biāo)物質(zhì)的響應(yīng)值，減少干擾。試驗(yàn)考察了Ru（bpy）32濃度在2～9 mmol/L范圍內(nèi)對(duì)多抗霉素和丙草胺電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作

分別吸取一定質(zhì)量的多抗霉素和丙草胺標(biāo)準(zhǔn)品，配制成多抗霉素和丙草胺質(zhì)量濃度分別為0.5 μg/L、5.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L、500.0 μg/L、1000.0 μg/L的混合標(biāo)液。將毛細(xì)管進(jìn)樣端插入緩沖液中，施加電泳電壓，啟動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀，約10 s后采用電動(dòng)進(jìn)樣進(jìn)行分離檢測(cè)，以樣品發(fā)光強(qiáng)度對(duì)樣品質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.4 樣品處理

稱取5.0 g樣品置于50 mL具塞離心管中，加入25 mL 甲醇-水提取液渦旋混勻10 min，超聲提取5 min，以4 000 r/min離心5 min，取上清液過WCX柱，1 mL甲醇洗脫，收集后的樣品溶液由去離子水稀釋后經(jīng)乙酸纖維素濾膜過濾后進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)電位對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的的影響

由圖1可知，不同檢測(cè)電位對(duì)多抗霉素和丙草胺的電發(fā)光強(qiáng)度影響不同，檢測(cè)電位＜0.8 V時(shí)，多抗霉素和丙草胺電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度均很弱；檢測(cè)電位＞0.8 V后，兩者電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，其中檢測(cè)電位為1.18 V時(shí)，兩者電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最強(qiáng)，丙草胺的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度比多抗霉素高；而高于1.18 V以后兩者電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度卻減弱。綜合考慮，選擇1.18 V作為檢測(cè)多抗霉素和丙草胺的最佳檢測(cè)電位。

圖1 多抗霉素和丙草胺的電化學(xué)發(fā)光曲線Fig.1 Electrochemiluminescence curves of polyxins and pretilachlor

2.2 檢測(cè)池條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測(cè)池中PBS濃度和pH的優(yōu)化

由圖2可知，當(dāng)PBS溶液濃度較低時(shí)，離子強(qiáng)度也小，電化學(xué)反應(yīng)受到抑制，多抗霉素和丙草胺的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度較弱；PBS溶液濃度越大，多抗霉素和丙草胺的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度越強(qiáng)，當(dāng)PBS溶液濃度為35 mmol/L時(shí)，多抗霉素和丙草胺的電化學(xué)強(qiáng)度最強(qiáng)，分別為1 802 mIU/L和1 390 mIU/L，故選擇35 mmol/L為最佳檢測(cè)緩沖溶液濃度。

圖2 磷酸鹽緩沖液濃度對(duì)多抗霉素和丙草胺電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of phosphate buffer solution concentration on the electrochemiluminescence intensity of polyxins and pretilachlor

由圖3可知，在pH 6.0～8.0的范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)多抗霉素和丙草胺的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著pH增大而增大；pH8.0時(shí)多抗霉素和丙草胺的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最強(qiáng)，分別為1 950 mIU/L和1 630 mIU/L；當(dāng)pH超過8.0時(shí)，兩者的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著pH增大而減小，因此選擇pH8.0為最佳的檢測(cè)池緩沖液pH。

圖3 檢測(cè)池緩沖液pH值對(duì)多抗霉素和丙草胺電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of pH of buffer solution in detection tank on the electrochemiluminescence intensity of polyoxins and pretilachlor

2.2.2 Ru（bpy）32濃度的優(yōu)化

由圖4可知，在Ru（bpy）32濃度為2～6 mmol/L范圍內(nèi)，多抗霉素和丙草胺的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著Ru（bpy）32濃度升高而升高，且基線穩(wěn)定，峰形良好；Ru（bpy）32濃度為6 mmol/L時(shí)，多抗霉素和丙草胺的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最強(qiáng)，分別為1 960 mIU/L和1 780 mIU/L；當(dāng)Ru（bpy）32濃度超過6 mmol/L時(shí)，雖然多抗霉素和丙草胺電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度有所增強(qiáng)，但是背景信號(hào)和基線噪音也隨之增加。綜合考慮各因素，選擇Ru（bpy）32濃度為6 mmol/L。

圖4 二氯三聯(lián)吡啶釕濃度對(duì)多抗霉素和丙草胺電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of Ru(bpy)32 concentration on the electrochemiluminescence intensity of polyoxins and pretilachlor

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

在最佳的條件下，采用CE-ECL對(duì)多抗霉素和丙草胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了分離檢測(cè)，兩者的電化學(xué)發(fā)光曲線如圖5所示。

圖5 多抗霉素和丙草胺的毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光曲線Fig.5 Capillary electrophoresis-electrochemiluminescence curves of polyoxins and pretilachlor

多抗霉素和丙草胺兩者的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表1。由表1可知，多抗霉素和丙草胺兩者的線性范圍為0.5～1 000.0 μg/L，線性回歸方程分別為Y=635.6X-11.2和Y=854.2X+67.8，相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.999 6、0.999 5，檢出限分別為0.05 μg/L、0.01 μg/L，定量限分別為0.20 μg/L、0.05 μg/L。

表1 多抗霉素和丙草胺的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1 Linear range,linear regression equation,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of polyoxins and pretilachlor

用CE-ECL檢測(cè)多抗霉素和丙草胺的檢測(cè)結(jié)果與用高效液相色譜法和其他方法檢測(cè)多抗霉素和丙草胺結(jié)果的比較見表2。從表2可見，與其他方法相比，采用CE-ECL方法檢測(cè)多抗霉素和丙草胺顯示出更高的靈敏度與較寬的線性范圍。

表2 檢測(cè)結(jié)果與其他方法的比較Table 2 Comparison between the results of the method and other methods

2.4 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.4.1 不同濃度甲醇溶液提取效果

以青菜樣品為實(shí)驗(yàn)對(duì)象并添加多抗霉素和丙草胺的混標(biāo)溶液，對(duì)不同含量（5%、10%、20%、30%、40%、50%）的甲醇水溶液作提取劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖6。

圖6 不同含量提取劑對(duì)多抗霉素和丙草胺電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of different concentrations of extractant on the electrochemiluminescence intensity of polyoxins and pretilachlor

由圖6可知，隨著甲醇含量的增加，提取液中多抗霉素和丙草胺的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在以30%甲醇作為提取溶液時(shí)兩者的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最高，分別為2 197 mIU/L和2 096 mIU/L；其他含量的甲醇溶液為提取劑時(shí)，組分含量分別有不同程度的降幅。

2.4.2 樣品稀釋液的選擇

由于樣品溶液進(jìn)行分析前要進(jìn)行前處理，用稀釋液定容，因此稀釋液的選擇也會(huì)對(duì)兩種目標(biāo)物的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度有影響。本實(shí)驗(yàn)分別用去離子水和PBS溶液對(duì)樣品溶液稀釋配成檢測(cè)溶液，電動(dòng)進(jìn)樣后分析比較。結(jié)果表明，去離子水稀釋的樣品溶液的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度較強(qiáng)，且遠(yuǎn)大于用PBS溶液稀釋的樣品溶液的ECL發(fā)光強(qiáng)度。故選擇去離子水作為稀釋液來配比檢測(cè)溶液。

2.5 加標(biāo)回收

以未檢出多抗霉素和丙草胺殘留的青菜樣品為基質(zhì)，分別加入0.001 mg/L、0.010 mg/L、0.100 mg/L質(zhì)量濃度的混合標(biāo)液，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。對(duì)樣品每一濃度進(jìn)行重復(fù)5次檢測(cè)，加標(biāo)回收率結(jié)果見表3。由表3可知，加標(biāo)回收率在86.5%～103.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為3.6%～5.2%，表明該方法能滿足殘留分析的要求。

表3 方法的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recovery rates and relative standard deviation of the method

3 結(jié)論

本研究利用毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光聯(lián)用法，通過對(duì)檢測(cè)電位的選擇、檢測(cè)條件的優(yōu)化，以及樣品提取液、稀釋液的比較，建立了同時(shí)檢測(cè)蔬菜中多抗霉素和丙草胺殘留的方法。結(jié)果表明，在1.18 V檢測(cè)電位、PBS溶液濃度為35 mmol/L、檢測(cè)池緩沖液pH 8.0和6 mmol/L Ru（bpy）32+的條件下，兩種目標(biāo)組分能在0.5～1 000 μg/mL范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，檢出限范圍為0.01～0.05 μg/L，定量限范圍為0.05～0.20 μg/L。樣品加入30%甲醇醇提取后經(jīng)WCX柱凈化富集后，用去離子水稀釋樣品液進(jìn)行檢測(cè)。樣品的加標(biāo)回收率能達(dá)到86.5%～103.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.6%～5.2%，所建立的方法能準(zhǔn)確快速有效地檢測(cè)蔬菜中的多抗霉素和丙草胺殘留量，可為此類的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。