基于香氣活力值分析白酒風味化合物對乙醇代謝關鍵酶的影響

曾禮蘭，劉嬡春，方 帥，孫 群，胡 承*

（四川大學 生命科學學院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川 成都 610065）

中國白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一。它通常由玉米、大米、小麥、豌豆、小米和高粱等谷物為原料，通過酒曲發(fā)酵，經(jīng)蒸煮、糖化、蒸餾、貯存、勾兌而成[1]。許多研究表明，適度飲酒有助于身體健康[2-3]，但過量飲酒也會導致多種疾病[4-5]。世界衛(wèi)生組織報告稱，每年有300萬人因濫用酒精而死亡[6]。白酒濫飲造成的傷亡和損失，通常被歸咎于酒中的乙醇[7]。然而，白酒中除乙醇和水（約占98%～99%），還有小部分溶于酒中的醇類、酯類、酸類以及醛酮類等有機物（約占1%～2%），雖然這些風味化合物的濃度很低，但其種類、組成及比例決定著白酒的口感、風味[8-9]。PENEDA J等[10]指出，在相同的乙醇濃度下，酒精飲料比純乙醇對人體肝臟組織造成的損害更大，因為乙醇及其同系物之間的相互作用增強了肝臟的氧化特性。此外，格絨澤仁等[11]通過對6款不同的濃香型白酒小鼠灌胃后的行為進行研究后，推斷正丙醇和異戊醇是飲用濃香型白酒后導致行為障礙的關鍵高級醇。

乙醇代謝涉及兩個過程：乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）將乙醇氧化成乙醛，然后乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）將乙醛氧化成乙酸[12]。由于乙醇、乙醛的積累會損害機體[13]，為增加乙醇脫氫酶或乙醛脫氫酶活性，提高人體乙醇代謝，許多研究人員正在研究某些天然化合物或非酒精飲料[14-16]。同時，白酒風味化合物對乙醇代謝的影響也逐漸引發(fā)關注。本研究以濃香型白酒為研究對象，通過氣相色譜分析和體外酶學實驗，以白酒中風味化合物的香氣活力值為基礎，探討了4種不同濃香型白酒中的10種醇、酯類物質(zhì)對ADH和ALDH活性的影響，為白酒風味化合物對乙醇代謝的影響提供了新的信息和研究模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃香型白酒（SC1：68%vol、SC2：48%vol、SC3：38%vol）：四川某酒廠；濃香型白酒（JS：40.8%vol）：江蘇某酒廠；正丙醇、正戊醇、正丁醇、異戊醇、異丁醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯和己酸乙酯標準品（色譜純）：天津精細化工研究所；乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）：美國Sigma-Aldrich公司；乙醇、乙醛（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；焦磷酸鈉、乙二胺四乙酸、吡唑、氫氧化鈉、巰基乙醇（分析純）：成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

7900II型氣相色譜儀：浙江福立分析儀器股份有限公司；（30 m×0.32 mm×1 μm）白酒專用色譜柱：四川知本分析科技有限公司；SQPPRACTUM224-1CN電子分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司；N4紫外可見光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；PHS-2C筆式pH計：上?？祪x儀器有限公司；DK-8D恒溫水浴鍋：上海躍進醫(yī)療器械有限公司；JB-2恒溫磁力攪拌器：上海雷磁新涇儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 濃香型白酒的氣相色譜分析

內(nèi)標的制備：以60%vol乙醇溶液為基體溶液，分別配制體積分數(shù)2%的叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸內(nèi)標溶液。

樣品的制備：吸取10.00 mL白酒樣品到比色管中，分別添加8.00 μL內(nèi)標（叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸）溶液，充分混勻。

色譜條件：福立7900II型氣相色譜儀上配有白酒專用色譜柱（30 m×0.32 mm×1 μm），檢測器溫度250 ℃，進樣口溫度250 ℃，柱流量為1.00 mL/min，分流比為1∶50。柱溫為程序性升溫，升溫條件：烘箱溫度最初為45 ℃，維持6 min，然后以6 ℃/min升溫至65 ℃，維持7 min，再以15 ℃/min升溫至200 ℃，維持6 min，最后以15 ℃/min升溫至210 ℃，維持10 min。

4種濃香型白酒均按照以上條件及方法進行氣相色譜分析，獲得4種白酒中風味物質(zhì)的種類和含量。

1.3.2 數(shù)據(jù)分析

定性分析：叔戊醇作內(nèi)標用于醇類的分析；乙酸正戊酯作內(nèi)標用于酯類及醛酮類組分的分析；2-乙基丁酸作內(nèi)標用于乙酸后流出的高沸點組分及乳酸乙酯的分析。根據(jù)各組分與標樣的保留時間作為定性的主要因素。

定量分析：采用內(nèi)標法計算。香氣活力值=風味物質(zhì)的含量/風味物質(zhì)的閾值。

1.3.3 體外酶學實驗

酒樣預處理：將10種風味化合物單體分別添加到4種濃香型白酒中，充分振蕩搖勻，風味化合物的添加量為1%（V/V），根據(jù)國家對血液酒精含量（blood alcohol concentration，BAC）的相關規(guī)定，實驗前將添加風味化合物的白酒稀釋至酒精度為0.1%vol。

乙醇脫氫酶活性的測定：將1.7 mL 0.1 mol/L焦磷酸鹽緩沖液（pH 8.8），0.1 mL 1.25 U/mL乙醇脫氫酶和0.1 mL樣品在30 ℃條件下混合，并加入1.0 mL 5 mmol/L NAD+啟動反應。為了繪制曲線，在15 min內(nèi)，測定反應體系OD340nm值。每組實驗重復3次。將無乙醇時的吸光度值設定為空白。

乙醛脫氫酶活性的測定：30 ℃條件下將1.4 mL 0.1 mol/L焦磷酸緩沖液（pH 9.0）、0.1 mL 0.8 U/mL乙醛脫氫酶、0.1 mL 0.1 mol/L乙醛、0.1 mL 0.01 mol/L吡唑、0.1 mL 3 mol/L氯化鉀、0.1 mL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸、0.05 mL 1 mol/L 2-巰基乙醇和0.1 mL樣品混合，加入1.0 mL 3.6 mmol/L NAD+引發(fā)反應。最后，在15 min內(nèi)，測量反應體系OD340nm值。每組實驗重復3次，按照下式計算酶活性抑制率：

式中：OD實驗組為濃香型白酒中加入某種風味物質(zhì)單體后的體系吸光度值；OD對照組為濃香型白酒的體系吸光度值；OD空白組為無乙醇時的體系吸光度值。

2 結果與分析

2.1 不同酒樣風味化合物香氣活力值分析

不同白酒的獨特香味的形成離不開酒中酯類、醇類、酸類以及其他的香味物質(zhì)的作用，通過香氣活力值（odor activityvalue，OAV），可以比較各香味物質(zhì)的呈香能力，OAV值大則表明該物質(zhì)對酒的呈香貢獻較大，反之則說明該物質(zhì)對酒的呈香貢獻相對較小，從而評估各風味化合物對酒的風味形成的貢獻程度[17]。根據(jù)氣相色譜法對4種濃香型白酒的定性、定量分析，結果如表1所示。

表1 氣相色譜分析4種濃香型白酒中風味化合物的含量及種類Table 1 Contents and kinds of flavor compounds in four varieties of strong-flavor Baijiu by gas chromatography

續(xù)表

由表1可知，4種酒樣共檢測出醇類9種，酯類9種，酸類7種，醛、酮及雜環(huán)類5種，其中酒樣SC3的風味化合物種類、總酯含量以及高級醇含量都低于其他3種酒樣，酒樣SC1中總酯含量和高級醇含量最高。

對風味物質(zhì)的OAV值進行計算，結果如表2所示。

由表2可知，酯類物質(zhì)的OAV值普遍高于酸類物質(zhì)的OAV值和醇類物質(zhì)的OAV值，其中己酸乙酯的含量和OAV值都最高，OAV＞7 000。此外，戊酸乙酯和丁酸乙酯的OAV值也遠遠高于其他風味物質(zhì)，在4種酒樣中均在800以上；酸類物質(zhì)中己酸的OAV值較高；醇類物質(zhì)中OAV值較高的是正丁醇，過量的雜醇油是酒中苦味的主要來源，其中正丁醇極苦[21]。

表2 4種濃香型白酒中風味物質(zhì)的香氣活力值Table 2 Odor activity value of flavor compounds in four varieties of strong-flavor Baijiu

由氣相色譜分析和OAV值可知，酯類物質(zhì)在4種濃香型白酒中具有較高含量和OAV值，這表明，酯類化合物對這4種酒的香味形成有重要貢獻，是酒中關鍵的香氣成分組成。而己酸可以通過酯化作用形成濃香型白酒的主體香己酸乙酯[22]；其次，醇類物質(zhì)是酒中的助香物質(zhì)，具有襯托酯香的作用，但酒中醇類含量過高，不僅會影響口感，還會導致酒后頭疼，出現(xiàn)飲后“上頭”現(xiàn)象[23]。因此，鑒于以上原因，研究主要以4種濃香型白酒中香氣貢獻較大的酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)為研究對象。

2.2 體外酶學實驗分析

酯類和醇類是白酒中必不可少的風味物質(zhì)，但酒中過量的酯類和醇類不利于人體健康。為了減少醇類物質(zhì)帶來的不利，許多降解酒中醇類的方法被陸續(xù)報道出來，如HAN Q等[24]從蘋果皮中提取了能降解酒中醇類物質(zhì)的酶。然而，關于降低酯類物質(zhì)的報道較少。作為自然釀造及固態(tài)蒸餾得到的白酒，這些微量成分的存在及其相對比例對酒固有風味的貢獻是不可缺少的。

本研究以常規(guī)的濃香型白酒作為對照，通過體外酶學實驗初步測定了濃香型白酒中的代表性酯類和醇類物質(zhì)對ADH和ALDH活性的影響，結果如圖1所示。

由圖1可知，向白酒中加入風味化合物后，除乳酸乙酯以外，所有風味化合物均抑制ADH的活性，且它們在不同的白酒中有不同的抑制率。大多數(shù)風味化合物的抑制率在20%以下，而SC1中正戊醇（27.64%）、異丁醇（29.32%）和戊酸乙酯（26.72%）的抑制率遠高于其他化合物；與對ADH活性的影響不同，除正丙醇外（抑制率＞7%），向白酒中添加醇類和酯類物質(zhì)可提高ALDH的活性（抑制率＜0%），且不同風味化合物抑制率的差異與白酒的種類無關。在這些化合物中，正丁醇和乙酸乙酯對ALDH活性的抑制率相似，約為-8%～-10%。研究中的大多數(shù)風味化合物，尤其是JS中的異丁醇，都提高了ALDH活性。然而，由于底物濃度效應，其活性仍然受到抑制，乙醇的代謝速率依然很低。醇類物質(zhì)抑制乙醇代謝關鍵酶的活性，降低乙醇的氧化速率，并且自身的氧化程度低于乙醇[25]，這可以部分解釋為什么醇類物質(zhì)含量不合理是酒后“上頭”的原因。

圖1 4種濃香型白酒中醇類、酯類對乙醇脫氫酶活性和乙醛脫氫酶活性的影響Fig.1 Effects of alcohols and esters in four strong-flavor Baijiu on alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase activities

由于SC1中正戊醇、異丁醇和戊酸乙酯的抑制率遠高于其他化合物，且SC1中正戊醇和戊酸乙酯的濃度高于其他3個濃香型白酒品種，探究了SC1中不同濃度的正戊醇、異丁醇和戊酸乙酯對ADH活性的影響，如圖2a所示，并進行了相關性分析，結果如圖2b～圖2d所示，它們對ADH活性的抑制具有劑量依賴性的（相關系數(shù)R2均＞0.9）。

圖2 不同濃度的風味化合物（a）、正戊醇（b）、異丁醇（c）和戊酸乙酯（d）對乙醇脫氫酶抑制率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of flavor compounds (a),1-pentanol (b),isobutanol (c) and ethyl pentanoate (d) on inhibition rate of alcohol dehydrogenase

綜上可初步判斷，研究中的風味化合物對ADH和ALDH活性的影響可分為三類：（1）絕大部分風味化合物抑制ADH活性，促進ALDH活性；（2）同時抑制ADH和ALDH活性，如正丙醇，它導致乙醇代謝受阻，乙醇大量積累；（3）輕度抑制或促進ADH活性，強烈促進ALDH活性，如乳酸乙酯，它將有利于提高飲后舒適度，以及降低乙醇、乙醛積累造成的患病風險。為了研究這些化合物對ADH活性影響和對ALDH活性影響之間的關系，進行了相關性分析，結果如圖3所示。

由圖3可知，這些化合物對ADH活性影響和對ALDH活性影響之間的相關性非常弱（相關系數(shù)R2＜0.15），這表明抑制（或促進）ADH活性的化合物不同于抑制（或促進）ALDH活性的化合物，尤其是在JS中（相關系數(shù)R2=0.054 7）。

圖3 4個濃香型白酒中醇、酯類物質(zhì)對乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶抑制率影響的相關性分析Fig.3 Correlation analysis of effects of alcohols and esters on the inhibition rates of ethanol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase in four varieties of strong-flavor Baijiu

3 結論

本研究結合氣相色譜、香氣活力值以及體外酶學實驗對4種濃香型白酒的風味化合物進行了研究，結果表明，酯類化合物是濃香型白酒中的關鍵香氣成分，對濃香型白酒的風味形成有重要貢獻，尤其是己酸乙酯（OAV≥7 284）、戊酸乙酯（OAV≥1 276）、丁酸乙酯（OAV≥845）；其次，多種酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)對ADH活性和ALDH活性的影響差異很大，對于ADH活性，除乳酸乙酯外，醇酯類物質(zhì)通常抑制ADH活性，其中正戊醇、異丁醇和戊酸乙酯的抑制率最高，分別為27.64%、29.32%和26.72%，而對于ALDH活性，除正丙醇外，醇酯類物質(zhì)會不同程度地促進ALDH活性。以上研究初步闡釋了酒類風味物質(zhì)對乙醇代謝關鍵酶作用效應，對于白酒酒體的設計與開發(fā)工作將有所啟發(fā)。