郭金玲,陳程鵬,周一郎,陳紅吉,呂育財(cái),任立偉,龔大春
(1.三峽大學(xué) 湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心,湖北 宜昌 443002;2.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院,湖北 宜昌 443002)
β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)又稱β-D-葡萄糖苷水解酶,是纖維素酶系的重要組成成分,可以水解β-D-葡萄糖苷鍵釋放出β-D-葡萄糖[1],被廣泛應(yīng)用于生物燃料[2-3]、食品[4-6]、醫(yī)藥保健品[7-8]等諸多領(lǐng)域,具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。因此,國(guó)內(nèi)外對(duì)β-葡萄糖苷酶研究日益增多,加快了其投入生產(chǎn)應(yīng)用的步伐。
微生物產(chǎn)β-葡萄糖苷酶具有生長(zhǎng)周期短,易于提取,操作成本低等優(yōu)點(diǎn)。目前,國(guó)內(nèi)外研究較多的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌為細(xì)菌中的芽孢桿菌屬(Bacillus),真菌中的木霉屬(Trichoderma)和曲霉屬(Aspergillus)。黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶不僅酶活性高,同時(shí),黑曲霉不產(chǎn)生有毒物質(zhì),安全可靠,是公認(rèn)的安全微生物[9]。因此,黑曲霉在產(chǎn)β-葡萄糖苷酶方面顯示了較大的潛力,為該酶的應(yīng)用和開發(fā)提供更廣闊的空間。目前已經(jīng)報(bào)道了多種來源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶,分子質(zhì)量分布在67~330 kDa之間,最適催化溫度為50~70 ℃,最適pH值為2.0~6.0,具有較廣泛的多樣性[4,10-13]。
本課題組前期已對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵產(chǎn)酶條件、β-葡萄糖苷酶在鮮人參皂苷生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用、β-葡萄糖苷酶的固定化和初步純化等進(jìn)行了研究[14-17]。本研究擬對(duì)黑曲霉產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行分離純化和性質(zhì)研究,以期進(jìn)一步了解其酶學(xué)性質(zhì),為其后續(xù)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 菌株
黑曲霉(Aspergillus niger):實(shí)驗(yàn)室保藏。
1.1.2 培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基[16]:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基,馬鈴薯200 g/L,葡萄糖20 g/L,瓊脂20 g/L,pH自然。
種子培養(yǎng)基[16]:葡萄糖60.0 g/L,麥芽粉8.0 g/L,硫酸銨10.0 g/L,磷酸二氫鉀5.0 g/L,硫酸鎂1.0 g/L,121 ℃滅菌20 min。
發(fā)酵培養(yǎng)基[16]:麥芽糖12.0 g/L,酵母膏4.0 g/L,磷酸二氫鉀2.0 g/L,硫酸鎂0.8 g/L,硫酸錳0.17 g/L,吐溫80 0.2%,pH 5.5,121 ℃滅菌20 min。
1.1.3 試劑
水楊素(純度≥99%):上海源葉生物科技有限公司;3,5-二硝基水楊酸(分析純):上海順強(qiáng)生物科技有限公司;季氨乙基-瓊脂糖凝膠FF(Q-Sepharose FF)離子交換層析填料、苯基-瓊脂糖凝膠6FF(Phenyl-Sepharose 6 FF)疏水層析填料、丁基-瓊脂糖凝膠HP(Butyl-Sepharose HP)疏水層析填料:美國(guó)GE公司;蛋白質(zhì)電泳試劑盒:上海碧云天生物科技有限公司;超濾離心管(10 kDa):德國(guó)默克密理博公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
AR2140型電子天平:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;PHS-3C型pH計(jì):上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;SX-700型蒸汽滅菌器:日本Tomy公司;SW-CT-1D型凈化工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備有限公司;ZQLY-180型振蕩培養(yǎng)箱:上海知楚儀器有限公司;MX-307型落地高速冷凍離心機(jī):日本Tomy公司;UV1800型紫外可見分光光度計(jì):日本島津公司;WH-861型微型旋渦混合儀:生工生物工程(上海)股份有限公司;BT1-100L-LCD型智能恒流泵、SBS-100-LCD型數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器:上海琪特分析儀器有限公司;UVD-680-3型紫外檢測(cè)儀:上海金達(dá)生化儀器有限公司;DYCZ-24DN型電泳儀:北京市六一儀器廠;WD-9405B型水平搖床:北京沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司。
1.3.1 粗酶液的制備
將甘油管保藏的黑曲霉孢子懸浮液劃線接種于斜面培養(yǎng)基,28 ℃活化5~7 d。將活化后的黑曲霉轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中,于28 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)48 h作為種子液。將種子液以10%(V/V)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,于28℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)4 d,除去菌絲體得到β-葡萄糖苷酶粗酶液,保存于4 ℃冰箱備用。
1.3.2β-葡萄糖苷酶活力的測(cè)定
參照文獻(xiàn)[16]測(cè)定β-葡萄糖苷酶活力。β-葡萄糖苷酶活力單位定義:在測(cè)定條件下,每分鐘釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位(U/mL)。
1.3.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定
采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[18]。
1.3.4β-葡萄糖苷酶的分離純化
硫酸銨鹽析[10]:取一定體積粗酶液于燒杯中,冰浴,采取兩種方案進(jìn)行鹽析。方案1(分級(jí)鹽析):在攪拌下緩慢加入硫酸銨粉末,使其飽和度達(dá)到35%,4 ℃靜置2 h使其完全沉淀,取鹽析液10 000 r/min離心15 min,上清液中繼續(xù)加入硫酸銨使其飽和度達(dá)到80%,4 ℃靜置使其完全沉淀,10 000 r/min離心15 min,收集沉淀,緩沖液復(fù)溶后透析過夜。方案2(一步鹽析):直接加硫酸銨至飽和度達(dá)到80%。
Q-Sepharose FF離子交換柱層析:20 mmol/L用磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)平衡色譜柱,取透析后粗酶液上樣。采用含0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L和1.0 mol/L NaCl的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)進(jìn)行梯度洗脫,洗脫流速為1 mL/min,收集各梯度洗脫液進(jìn)行酶活性檢測(cè),合并有酶活性的洗脫液進(jìn)行進(jìn)一步純化。
Phenyl-Sepharose6FF疏水層析柱層析:將經(jīng)過離子交換層析后的酶液用超濾管濃縮并將緩沖液更換為含1.0 mol/L硫酸銨的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0),上樣后以降低硫酸銨濃度的方式進(jìn)行梯度洗脫,即分別用含1.0 mol/L、0.8 mol/L、0.6 mol/L、0.4 mol/L、0.2 mol/L和0 mol/L硫酸銨的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)進(jìn)行洗脫,收集有酶活性的洗脫液。
Butyl-Sepharose HP疏水層析柱層析:方法同Phenyl-Sepharose 6 FF層析柱層析進(jìn)行梯度洗脫,洗脫流速為1.5 mL/min,收集有酶活性的洗脫液。
1.3.5β-葡萄糖苷酶蛋白純度及相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定
酶蛋白純度及相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)法,SDS-PAGE條件:濃縮膠5%,分離膠10%;濃縮膠選用80 V固定直流電壓,待進(jìn)入分離膠時(shí)改用110 V直流電壓。電泳結(jié)束后倒入考馬斯亮藍(lán)R250染色液,在搖床上振蕩染色0.5 h,蒸餾水反復(fù)沖洗幾次后加入脫色液(乙醇冰醋酸溶液),在搖床上振蕩脫色至蛋白質(zhì)條帶清晰可見。
1.3.6β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)
最適反應(yīng)溫度:在溫度30~80 ℃條件下按照方法1.3.2測(cè)定酶活。將最高酶活定義為100%,分別計(jì)算不同反應(yīng)溫度下的相對(duì)酶活。
熱穩(wěn)定性:將待測(cè)酶液置于30~80℃條件下保溫30min,冷卻后按照方法1.3.2測(cè)定酶活。以未保溫酶活為100%,分別計(jì)算在不同溫度下保溫后的相對(duì)酶活。
最適反應(yīng)pH值:在pH值1.0~8.0條件下按照方法1.3.2測(cè)定酶活。將最高酶活定義為100%,分別計(jì)算不同pH值下的相對(duì)酶活。
pH值穩(wěn)定性:在4 ℃條件下,將純化后的酶液置于pH 1.0~8.0的緩沖液中處理3 h,按照方法1.3.2測(cè)定酶活。將未處理的酶活定義為100%,分別計(jì)算不同pH值下處理后的相對(duì)酶活。
2.1.1 硫酸銨鹽析
β-葡萄糖苷酶粗酶液經(jīng)硫酸銨鹽析后,測(cè)定總酶活、總蛋白含量、比酶活、純化倍數(shù)及回收率,結(jié)果見表1。由表1可知,分級(jí)沉淀(方案1)的回收率為47.26%,低于一步鹽析(方案2)(59.90%),但純化倍數(shù)(2.84)較高,除去了更多的雜蛋白。為了在保證一定回收率的基礎(chǔ)上達(dá)到更好的純化效果,本實(shí)驗(yàn)采用硫酸銨飽和度為35%~80%的分級(jí)鹽析方法。
表1 硫酸銨鹽析結(jié)果Table 1 Results for ammonium sulfate precipitation
2.1.2 Q-Sepharose FF離子交換柱層析
Q-Sepharose FF離子交換層析洗脫曲線見圖1。由圖1可知,脫鹽后的粗酶液經(jīng)Q-Sepharose FF離子交換柱層析分離后,共得到4個(gè)洗脫峰,其中第3個(gè)洗脫峰具有β-葡萄糖苷酶活力,即β-葡萄糖苷酶在NaCl濃度達(dá)到0.6 mol/L時(shí)被洗脫下來,其余的洗脫峰均無β-葡萄糖苷酶活力,為雜蛋白。將0.6 mol/L洗脫液進(jìn)行回收合并,測(cè)定得到總β-葡萄糖苷酶活力為27.42 U,總蛋白質(zhì)含量為1.89 mg,比酶活為14.5 U/mg,純化倍數(shù)達(dá)到7.04倍,回收率為24.66%。
圖1 β-葡萄糖苷酶經(jīng)Q-Sepharose FF離子交換層析洗脫色譜圖Fig.1 Chromatogram of β-glucosidase after elution with Q-Sepharose FF ion exchange column chromatography
2.1.3 Phenyl-Sepharose 6 FF疏水柱層析
Phenyl-Sepharose 6 FF疏水柱層析洗脫曲線見圖2。由圖2可知,粗酶液經(jīng)Phenyl Sepharose 6 FF疏水柱層析分離后,共得到6個(gè)洗脫峰,其中第4個(gè)洗脫峰具有β-葡萄糖苷酶活力,即β-葡萄糖苷酶在硫酸銨濃度達(dá)到0.4 mol/L時(shí)被洗脫下來,其余的洗脫峰均無β-葡萄糖苷酶活力,為雜蛋白。將0.4 mol/L洗脫液進(jìn)行回收合并,測(cè)定其總酶活為10.71 U,總蛋白質(zhì)含量為0.15 mg,比酶活為71.40 U/mg,純化倍數(shù)達(dá)到35.66倍,回收率為9.59%。
圖2 β-葡萄糖苷酶經(jīng)Phenyl Sepharose 6 FF疏水層析洗脫色譜圖Fig.2 Chromatogram of β-glucosidase after elution with Phenyl Sepharose 6 FF hydrophobic chromatography
2.1.4 Butyl-Sepharose HP柱層析
Butyl-Sepharose HP疏水柱層析洗脫曲線見圖3。由圖3可知,酶液經(jīng)Butyl Sepharose 6 HP疏水柱層析分離后,共得到5個(gè)洗脫峰,其中第3個(gè)洗脫峰具有β-葡萄糖苷酶活力,即β-葡萄糖苷酶在硫酸銨濃度達(dá)到0.6 mol/L時(shí)被洗脫下來,其余的洗脫峰均無β-葡萄糖苷酶活力,為雜蛋白。將0.6 mol/L洗脫液進(jìn)行回收合并,測(cè)定其總酶活為5.19 U,蛋白質(zhì)含量為0.05 mg,比酶活為103.8 U/mg,純化倍數(shù)達(dá)到50.39倍,回收率為4.65%。
圖3 β-葡萄糖苷酶經(jīng)Butyl Sepharose HP疏水層析洗脫色譜圖Fig.3 Chromatogram of β-glucosidase after elution with Butyl Sepharose HP hydrophobic chromatography
2.1.5β-葡萄糖苷酶分離純化結(jié)果
β-葡萄糖苷酶各步純化結(jié)果見表2。
表2 β-葡萄糖苷酶純化結(jié)果匯總Table 2 Summary of β-glucosidase purification results
β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE結(jié)果見圖4。由圖4可知,β-葡萄糖苷酶的分子質(zhì)量約為116 kDa,與徐星等[10-11]報(bào)道的黑曲霉β-葡萄糖苷酶分子質(zhì)量大小相近,而NARASIMHA G等[12]報(bào)道的來源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶的分子質(zhì)量約為95 kDa,王劍鋒等[13]報(bào)道的來源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶的分子質(zhì)量分別為102 kDa和97 kDa,與本研究報(bào)道的β-葡萄糖苷酶的分子質(zhì)量存在較大差別,表明來源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶具有廣泛的多樣性。
圖4 黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶SDS-PAGE結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE result of β-glucosidase from Aspergillus niger
2.3.1 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性
通常,隨著反應(yīng)溫度的升高,酶反應(yīng)速度加快,但是當(dāng)溫度升高到一定程度后,酶蛋白變性失活,反應(yīng)速度隨之降低。溫度對(duì)黑曲霉β-葡萄糖苷酶活性的影響見圖5。由圖5可知,隨著反應(yīng)溫度的升高該酶活性逐漸升高,當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)酶活力最大,但是當(dāng)溫度超過60 ℃后酶活迅速降低,因此,確定該β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃,與KARAMI F等[19-20]報(bào)道的黑曲霉β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度相近。
圖5 溫度對(duì)黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of β-glucosidase from Aspergillus niger
黑曲霉β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性結(jié)果見圖6。由圖6可知,該β-葡萄糖苷酶在30~50 ℃范圍內(nèi)較穩(wěn)定,溫度超過50 ℃后,β-葡萄糖苷酶的穩(wěn)定性逐漸下降。因此,確定該β-葡萄糖苷酶在溫度30~50 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性好。
圖6 黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermostability of β-glucosidase from Aspergillus niger
2.3.2 最適反應(yīng)pH值和pH穩(wěn)定性
pH值會(huì)影響酶活性中心必需氨基酸的解離狀態(tài)和底物的解離狀態(tài),從而影響酶的反應(yīng)速度。pH值對(duì)黑曲霉β-葡萄糖苷酶活性的影響見圖7。由圖7可知,隨著反應(yīng)pH值的升高,β-葡萄糖苷酶活性呈先升高后下降的趨勢(shì),當(dāng)反應(yīng)pH值為5時(shí),β-葡萄糖苷酶活性最高,因此,確定該β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH值為5。
圖7 pH值對(duì)黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.7 Effect of pH value on the activity of β-glucosidase from Aspergillus niger
黑曲霉β-葡萄糖苷酶的pH值穩(wěn)定性結(jié)果見圖8。
圖8 黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的pH穩(wěn)定性Fig.8 pH stability of β-glucosidase from Aspergillus niger
由圖8可知,在pH 2.0~8.0的緩沖液中處理3 h,該β-葡萄糖苷酶仍然可以保留80%以上的酶活性,較好的pH穩(wěn)定性利于該酶在不同領(lǐng)域的應(yīng)用。因此,確定該β-葡萄糖苷酶在pH值2.0~8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性好。
本研究利用硫酸銨鹽析、Q-Sepharose FF離子交換層析、Phenyl-Sepharose 6 FF疏水層析和Butyl-Sepharose HP疏水層析對(duì)黑曲霉來源β-葡萄糖苷酶進(jìn)行分離純化,并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明,經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析、3步柱層析后,β-葡萄糖苷酶的比酶活達(dá)到103.80 U/mg,純化倍數(shù)達(dá)到50.39倍,回收率為4.65%。利用SDS-PAGE測(cè)定該β-葡萄糖苷酶的分子質(zhì)量約為116 kDa。該酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃,最適反應(yīng)pH值為5.0,在溫度30~50 ℃、pH 2.0~8.0之間具有較好的穩(wěn)定性,較寬的pH穩(wěn)定性表明該酶有較好的潛在應(yīng)用價(jià)值。