黑曲霉β-葡萄糖苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

郭金玲，陳程鵬，周一郎，陳紅吉，呂育財(cái)，任立偉，龔大春

（1.三峽大學(xué) 湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002）

β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，是纖維素酶系的重要組成成分，可以水解β-D-葡萄糖苷鍵釋放出β-D-葡萄糖[1]，被廣泛應(yīng)用于生物燃料[2-3]、食品[4-6]、醫(yī)藥保健品[7-8]等諸多領(lǐng)域，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。因此，國(guó)內(nèi)外對(duì)β-葡萄糖苷酶研究日益增多，加快了其投入生產(chǎn)應(yīng)用的步伐。

微生物產(chǎn)β-葡萄糖苷酶具有生長(zhǎng)周期短，易于提取，操作成本低等優(yōu)點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外研究較多的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌為細(xì)菌中的芽孢桿菌屬（Bacillus），真菌中的木霉屬（Trichoderma）和曲霉屬（Aspergillus）。黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶不僅酶活性高，同時(shí)，黑曲霉不產(chǎn)生有毒物質(zhì)，安全可靠，是公認(rèn)的安全微生物[9]。因此，黑曲霉在產(chǎn)β-葡萄糖苷酶方面顯示了較大的潛力，為該酶的應(yīng)用和開發(fā)提供更廣闊的空間。目前已經(jīng)報(bào)道了多種來源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶，分子質(zhì)量分布在67～330 kDa之間，最適催化溫度為50～70 ℃，最適pH值為2.0～6.0，具有較廣泛的多樣性[4，10-13]。

本課題組前期已對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵產(chǎn)酶條件、β-葡萄糖苷酶在鮮人參皂苷生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用、β-葡萄糖苷酶的固定化和初步純化等進(jìn)行了研究[14-17]。本研究擬對(duì)黑曲霉產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行分離純化和性質(zhì)研究，以期進(jìn)一步了解其酶學(xué)性質(zhì)，為其后續(xù)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

黑曲霉（Aspergillus niger）：實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基[16]：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然。

種子培養(yǎng)基[16]：葡萄糖60.0 g/L，麥芽粉8.0 g/L，硫酸銨10.0 g/L，磷酸二氫鉀5.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[16]：麥芽糖12.0 g/L，酵母膏4.0 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，硫酸鎂0.8 g/L，硫酸錳0.17 g/L，吐溫80 0.2%，pH 5.5，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

水楊素（純度≥99%）：上海源葉生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（分析純）：上海順強(qiáng)生物科技有限公司；季氨乙基-瓊脂糖凝膠FF（Q-Sepharose FF）離子交換層析填料、苯基-瓊脂糖凝膠6FF（Phenyl-Sepharose 6 FF）疏水層析填料、丁基-瓊脂糖凝膠HP（Butyl-Sepharose HP）疏水層析填料：美國(guó)GE公司；蛋白質(zhì)電泳試劑盒：上海碧云天生物科技有限公司；超濾離心管（10 kDa）：德國(guó)默克密理博公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2140型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3C型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SX-700型蒸汽滅菌器：日本Tomy公司；SW-CT-1D型凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZQLY-180型振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；MX-307型落地高速冷凍離心機(jī)：日本Tomy公司；UV1800型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；WH-861型微型旋渦混合儀：生工生物工程（上海）股份有限公司；BT1-100L-LCD型智能恒流泵、SBS-100-LCD型數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器：上海琪特分析儀器有限公司；UVD-680-3型紫外檢測(cè)儀：上海金達(dá)生化儀器有限公司；DYCZ-24DN型電泳儀：北京市六一儀器廠；WD-9405B型水平搖床：北京沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

將甘油管保藏的黑曲霉孢子懸浮液劃線接種于斜面培養(yǎng)基，28 ℃活化5～7 d。將活化后的黑曲霉轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)48 h作為種子液。將種子液以10%（V/V）的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于28℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)4 d，除去菌絲體得到β-葡萄糖苷酶粗酶液，保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.2β-葡萄糖苷酶活力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[16]測(cè)定β-葡萄糖苷酶活力。β-葡萄糖苷酶活力單位定義：在測(cè)定條件下，每分鐘釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[18]。

1.3.4β-葡萄糖苷酶的分離純化

硫酸銨鹽析[10]：取一定體積粗酶液于燒杯中，冰浴，采取兩種方案進(jìn)行鹽析。方案1（分級(jí)鹽析）：在攪拌下緩慢加入硫酸銨粉末，使其飽和度達(dá)到35%，4 ℃靜置2 h使其完全沉淀，取鹽析液10 000 r/min離心15 min，上清液中繼續(xù)加入硫酸銨使其飽和度達(dá)到80%，4 ℃靜置使其完全沉淀，10 000 r/min離心15 min，收集沉淀，緩沖液復(fù)溶后透析過夜。方案2（一步鹽析）：直接加硫酸銨至飽和度達(dá)到80%。

Q-Sepharose FF離子交換柱層析：20 mmol/L用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）平衡色譜柱，取透析后粗酶液上樣。采用含0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L和1.0 mol/L NaCl的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為1 mL/min，收集各梯度洗脫液進(jìn)行酶活性檢測(cè)，合并有酶活性的洗脫液進(jìn)行進(jìn)一步純化。

Phenyl-Sepharose6FF疏水層析柱層析：將經(jīng)過離子交換層析后的酶液用超濾管濃縮并將緩沖液更換為含1.0 mol/L硫酸銨的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），上樣后以降低硫酸銨濃度的方式進(jìn)行梯度洗脫，即分別用含1.0 mol/L、0.8 mol/L、0.6 mol/L、0.4 mol/L、0.2 mol/L和0 mol/L硫酸銨的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）進(jìn)行洗脫，收集有酶活性的洗脫液。

Butyl-Sepharose HP疏水層析柱層析：方法同Phenyl-Sepharose 6 FF層析柱層析進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為1.5 mL/min，收集有酶活性的洗脫液。

1.3.5β-葡萄糖苷酶蛋白純度及相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

酶蛋白純度及相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法，SDS-PAGE條件：濃縮膠5%，分離膠10%；濃縮膠選用80 V固定直流電壓，待進(jìn)入分離膠時(shí)改用110 V直流電壓。電泳結(jié)束后倒入考馬斯亮藍(lán)R250染色液，在搖床上振蕩染色0.5 h，蒸餾水反復(fù)沖洗幾次后加入脫色液（乙醇冰醋酸溶液），在搖床上振蕩脫色至蛋白質(zhì)條帶清晰可見。

1.3.6β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

最適反應(yīng)溫度：在溫度30～80 ℃條件下按照方法1.3.2測(cè)定酶活。將最高酶活定義為100%，分別計(jì)算不同反應(yīng)溫度下的相對(duì)酶活。

熱穩(wěn)定性：將待測(cè)酶液置于30～80℃條件下保溫30min，冷卻后按照方法1.3.2測(cè)定酶活。以未保溫酶活為100%，分別計(jì)算在不同溫度下保溫后的相對(duì)酶活。

最適反應(yīng)pH值：在pH值1.0～8.0條件下按照方法1.3.2測(cè)定酶活。將最高酶活定義為100%，分別計(jì)算不同pH值下的相對(duì)酶活。

pH值穩(wěn)定性：在4 ℃條件下，將純化后的酶液置于pH 1.0～8.0的緩沖液中處理3 h，按照方法1.3.2測(cè)定酶活。將未處理的酶活定義為100%，分別計(jì)算不同pH值下處理后的相對(duì)酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-葡萄糖苷酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨鹽析

β-葡萄糖苷酶粗酶液經(jīng)硫酸銨鹽析后，測(cè)定總酶活、總蛋白含量、比酶活、純化倍數(shù)及回收率，結(jié)果見表1。由表1可知，分級(jí)沉淀（方案1）的回收率為47.26%，低于一步鹽析（方案2）（59.90%），但純化倍數(shù)（2.84）較高，除去了更多的雜蛋白。為了在保證一定回收率的基礎(chǔ)上達(dá)到更好的純化效果，本實(shí)驗(yàn)采用硫酸銨飽和度為35%～80%的分級(jí)鹽析方法。

表1 硫酸銨鹽析結(jié)果Table 1 Results for ammonium sulfate precipitation

2.1.2 Q-Sepharose FF離子交換柱層析

Q-Sepharose FF離子交換層析洗脫曲線見圖1。由圖1可知，脫鹽后的粗酶液經(jīng)Q-Sepharose FF離子交換柱層析分離后，共得到4個(gè)洗脫峰，其中第3個(gè)洗脫峰具有β-葡萄糖苷酶活力，即β-葡萄糖苷酶在NaCl濃度達(dá)到0.6 mol/L時(shí)被洗脫下來，其余的洗脫峰均無β-葡萄糖苷酶活力，為雜蛋白。將0.6 mol/L洗脫液進(jìn)行回收合并，測(cè)定得到總β-葡萄糖苷酶活力為27.42 U，總蛋白質(zhì)含量為1.89 mg，比酶活為14.5 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到7.04倍，回收率為24.66%。

圖1 β-葡萄糖苷酶經(jīng)Q-Sepharose FF離子交換層析洗脫色譜圖Fig.1 Chromatogram of β-glucosidase after elution with Q-Sepharose FF ion exchange column chromatography

2.1.3 Phenyl-Sepharose 6 FF疏水柱層析

Phenyl-Sepharose 6 FF疏水柱層析洗脫曲線見圖2。由圖2可知，粗酶液經(jīng)Phenyl Sepharose 6 FF疏水柱層析分離后，共得到6個(gè)洗脫峰，其中第4個(gè)洗脫峰具有β-葡萄糖苷酶活力，即β-葡萄糖苷酶在硫酸銨濃度達(dá)到0.4 mol/L時(shí)被洗脫下來，其余的洗脫峰均無β-葡萄糖苷酶活力，為雜蛋白。將0.4 mol/L洗脫液進(jìn)行回收合并，測(cè)定其總酶活為10.71 U，總蛋白質(zhì)含量為0.15 mg，比酶活為71.40 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到35.66倍，回收率為9.59%。

圖2 β-葡萄糖苷酶經(jīng)Phenyl Sepharose 6 FF疏水層析洗脫色譜圖Fig.2 Chromatogram of β-glucosidase after elution with Phenyl Sepharose 6 FF hydrophobic chromatography

2.1.4 Butyl-Sepharose HP柱層析

Butyl-Sepharose HP疏水柱層析洗脫曲線見圖3。由圖3可知，酶液經(jīng)Butyl Sepharose 6 HP疏水柱層析分離后，共得到5個(gè)洗脫峰，其中第3個(gè)洗脫峰具有β-葡萄糖苷酶活力，即β-葡萄糖苷酶在硫酸銨濃度達(dá)到0.6 mol/L時(shí)被洗脫下來，其余的洗脫峰均無β-葡萄糖苷酶活力，為雜蛋白。將0.6 mol/L洗脫液進(jìn)行回收合并，測(cè)定其總酶活為5.19 U，蛋白質(zhì)含量為0.05 mg，比酶活為103.8 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到50.39倍，回收率為4.65%。

圖3 β-葡萄糖苷酶經(jīng)Butyl Sepharose HP疏水層析洗脫色譜圖Fig.3 Chromatogram of β-glucosidase after elution with Butyl Sepharose HP hydrophobic chromatography

2.1.5β-葡萄糖苷酶分離純化結(jié)果

β-葡萄糖苷酶各步純化結(jié)果見表2。

表2 β-葡萄糖苷酶純化結(jié)果匯總Table 2 Summary of β-glucosidase purification results

2.2 β-葡萄糖苷酶分子質(zhì)量的測(cè)定

β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE結(jié)果見圖4。由圖4可知，β-葡萄糖苷酶的分子質(zhì)量約為116 kDa，與徐星等[10-11]報(bào)道的黑曲霉β-葡萄糖苷酶分子質(zhì)量大小相近，而NARASIMHA G等[12]報(bào)道的來源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶的分子質(zhì)量約為95 kDa，王劍鋒等[13]報(bào)道的來源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶的分子質(zhì)量分別為102 kDa和97 kDa，與本研究報(bào)道的β-葡萄糖苷酶的分子質(zhì)量存在較大差別，表明來源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶具有廣泛的多樣性。

圖4 黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶SDS-PAGE結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE result of β-glucosidase from Aspergillus niger

2.3 β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

通常，隨著反應(yīng)溫度的升高，酶反應(yīng)速度加快，但是當(dāng)溫度升高到一定程度后，酶蛋白變性失活，反應(yīng)速度隨之降低。溫度對(duì)黑曲霉β-葡萄糖苷酶活性的影響見圖5。由圖5可知，隨著反應(yīng)溫度的升高該酶活性逐漸升高，當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)酶活力最大，但是當(dāng)溫度超過60 ℃后酶活迅速降低，因此，確定該β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，與KARAMI F等[19-20]報(bào)道的黑曲霉β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度相近。

圖5 溫度對(duì)黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of β-glucosidase from Aspergillus niger

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性結(jié)果見圖6。由圖6可知，該β-葡萄糖苷酶在30～50 ℃范圍內(nèi)較穩(wěn)定，溫度超過50 ℃后，β-葡萄糖苷酶的穩(wěn)定性逐漸下降。因此，確定該β-葡萄糖苷酶在溫度30～50 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性好。

圖6 黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermostability of β-glucosidase from Aspergillus niger

2.3.2 最適反應(yīng)pH值和pH穩(wěn)定性

pH值會(huì)影響酶活性中心必需氨基酸的解離狀態(tài)和底物的解離狀態(tài)，從而影響酶的反應(yīng)速度。pH值對(duì)黑曲霉β-葡萄糖苷酶活性的影響見圖7。由圖7可知，隨著反應(yīng)pH值的升高，β-葡萄糖苷酶活性呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)pH值為5時(shí)，β-葡萄糖苷酶活性最高，因此，確定該β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH值為5。

圖7 pH值對(duì)黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.7 Effect of pH value on the activity of β-glucosidase from Aspergillus niger

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的pH值穩(wěn)定性結(jié)果見圖8。

圖8 黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的pH穩(wěn)定性Fig.8 pH stability of β-glucosidase from Aspergillus niger

由圖8可知，在pH 2.0～8.0的緩沖液中處理3 h，該β-葡萄糖苷酶仍然可以保留80%以上的酶活性，較好的pH穩(wěn)定性利于該酶在不同領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，確定該β-葡萄糖苷酶在pH值2.0～8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性好。

3 結(jié)論

本研究利用硫酸銨鹽析、Q-Sepharose FF離子交換層析、Phenyl-Sepharose 6 FF疏水層析和Butyl-Sepharose HP疏水層析對(duì)黑曲霉來源β-葡萄糖苷酶進(jìn)行分離純化，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析、3步柱層析后，β-葡萄糖苷酶的比酶活達(dá)到103.80 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到50.39倍，回收率為4.65%。利用SDS-PAGE測(cè)定該β-葡萄糖苷酶的分子質(zhì)量約為116 kDa。該酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，最適反應(yīng)pH值為5.0，在溫度30～50 ℃、pH 2.0～8.0之間具有較好的穩(wěn)定性，較寬的pH穩(wěn)定性表明該酶有較好的潛在應(yīng)用價(jià)值。