工藝條件對(duì)殺菌型褐色乳酸菌飲料穩(wěn)定性的影響

余志堅(jiān)，姚夢(mèng)柯，張 敏，陳 超，曹永強(qiáng)，楊貞耐，*

（1.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京食品營(yíng)養(yǎng)與健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048；2.贛州市畜牧研究所，江西 贛州 341000；3.東君乳業(yè)（禹城）有限公司，山東 德州 253000）

褐色乳酸菌飲料通常以脫脂乳粉和葡萄糖為原料，經(jīng)褐變反應(yīng)后接種乳酸菌發(fā)酵得到發(fā)酵乳，然后以此為基料，加入水、甜味劑、酸味劑、穩(wěn)定劑、香精調(diào)配而成[1]。其具有促進(jìn)人體腸道健康[2]、降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[3]、調(diào)節(jié)膽固醇代謝[4]、降血脂和抗炎等作用[5]。褐色乳酸菌飲料以日本的養(yǎng)樂多為代表，近年來(lái)以獨(dú)特的風(fēng)味日益風(fēng)靡全球。國(guó)內(nèi)的蒙牛優(yōu)益C、伊利每益添、光明的暢優(yōu)、君樂寶慢醇炭燒酸奶都是代表產(chǎn)品，受到民眾的廣泛喜愛，市場(chǎng)前景廣闊[6]。

目前，褐色乳酸菌飲料根據(jù)產(chǎn)品罐裝后是否經(jīng)過二次殺菌可分為殺菌型和活菌型[7]?；罹彤a(chǎn)品不經(jīng)過殺菌，在整個(gè)流通過程中需要全程冷鏈運(yùn)輸。殺菌型產(chǎn)品可在常溫下可保存6個(gè)月以上，利于保藏和運(yùn)輸。但熱處理同時(shí)使物料混合體系不穩(wěn)定，導(dǎo)致產(chǎn)品運(yùn)輸貯藏過程中易出現(xiàn)分層、沉淀等現(xiàn)象。因此，有必要研究褐色乳酸菌飲料生產(chǎn)工藝條件，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性。韓梅等[8]發(fā)現(xiàn)葡萄糖比蔗糖更適合褐色乳酸菌飲料生產(chǎn)中的美拉德反應(yīng)。馬志梅[9]就美拉德反應(yīng)對(duì)酸奶凝膠結(jié)構(gòu)造成的影響提出了復(fù)配穩(wěn)定劑這一方案，用正交實(shí)驗(yàn)確定出復(fù)配穩(wěn)定劑，提升褐色酸奶在儲(chǔ)藏期的穩(wěn)定性。ZHOU P等[10]研究美拉德反應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)的修飾聚集作用后以糖醇代替還原糖改善了蛋白質(zhì)質(zhì)地硬化。王曉研等[11]指出了影響褐色乳酸菌飲料穩(wěn)定性的因素，并提出了可以通過添加穩(wěn)定劑、螯合劑以及抑菌物質(zhì)等方法來(lái)提高褐色乳酸菌飲料的穩(wěn)定性。

本研究首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，探究不同工藝條件對(duì)飲料生產(chǎn)過程各工藝階段物料不穩(wěn)定指數(shù)的影響。然后以褐變時(shí)間、均質(zhì)壓力和果膠用量為自變量，以粒徑、zeta電位、離心沉淀率和不穩(wěn)定指數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳工藝條件，旨在提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

葡萄糖（食品級(jí)）：山東西王糖業(yè)有限公司；白砂糖（食品級(jí)）：太古糖業(yè)（中國(guó)）有限公司；鮮牛乳：北京半截河奶牛場(chǎng)；中溫脫脂乳粉（食品級(jí)）：恒安然乳品有限公司；果膠（食品級(jí)）：河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）N1115：石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司；檸檬酸（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CP124S分析天平：德國(guó)startorius公司；CR21GⅢ臺(tái)式離心機(jī)：日本Hitachi公司；R30攪拌器：上海弗魯克流體機(jī)械有限公司；HWS12恒溫水浴鍋，DHG-9055A鼓風(fēng)干燥箱，THZ-D電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HZQ-Q振蕩器：東聯(lián)電子技術(shù)有限公司；D-3L高壓均質(zhì)機(jī)：美國(guó)phd-tech公司；Nano 900粒徑電位儀：馬爾文儀器有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器：日本三洋公司；Lumisizer穩(wěn)定性分析儀：德國(guó)LUM公司；BCN-1360B超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司；0.45 μm聚丙烯有機(jī)濾膜：海寧科維過濾設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 褐色乳酸菌飲料的生產(chǎn)工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：90 ℃熱水溶解葡萄糖10 g，冷卻至45 ℃后溶解中溫脫脂乳粉12 g，剪切乳化15 min、靜置水合30min，水合后定容至100 mL；將混合物進(jìn)行均質(zhì)處理（65 ℃、15 MPa），然后殺菌（65 ℃、30 min）。95 ℃高溫褐變155～165 min至標(biāo)準(zhǔn)顏色，充分冷卻至39℃，接種109CFU/g的干酪乳桿菌N1115菌粉1 g，混合均勻后，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后剪切破乳，22～30 MPa壓力下均質(zhì)后備用；取上述發(fā)酵液25 mL添加白砂糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%）、2.0～2.8 g/L的果膠等輔料，剪切乳化后用10%檸檬酸調(diào)pH為3.8后定容至1 000 mL。將料液熱均質(zhì)（65 ℃、25 MPa），然后灌裝。將灌裝后的飲料85 ℃殺菌30 min，冷卻后4 ℃保藏，得褐色乳酸菌飲料。

1.3.2 工藝條件優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：飲料生產(chǎn)過程中，控制初始條件為褐變溫度95 ℃，褐變時(shí)間為150 min，均質(zhì)壓力20 MPa，果膠添加量為2.0 g/L。保持其他條件不變，改變其中一個(gè)條件，分別考察褐變時(shí)間（120 min、130 min、140 min、150 min、160 min、170 min），均質(zhì)壓力（15 MPa、20 MPa、25 MPa、30 MPa、35 MPa、40 MPa），果膠用量（1.0 g/L、1.5 g/L、2.0g/L、2.5 g/L、3.0 g/L、3.5 g/L）對(duì)飲料穩(wěn)定性的影響。

正交試驗(yàn)：根據(jù)單因素試驗(yàn)分析結(jié)果，選擇褐變時(shí)間、均質(zhì)壓力和果膠用量作為變量，以粒徑、電位、離心沉淀率和不穩(wěn)定指數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化褐色乳酸菌飲料生產(chǎn)工藝。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 褐色乳酸菌飲料生產(chǎn)工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for brown lactic acid bacterial beverage production process optimization

1.3.3 飲料穩(wěn)定性指標(biāo)測(cè)定

斯托克斯定律描述了顆粒的沉降速度與顆粒和流體的半徑和黏度的關(guān)系，顆粒沉降速度計(jì)算公式如下：

式中：V為顆粒沉降速度，m/s；r為顆粒半徑，m；ρs為顆粒密度，kg/m3；ρf為流體密度，kg/m3；g為重力加速度，大小為9.81 m/s2；η為流體黏度，Pa·s。

采用斯托克斯定律判定飲料的沉降過程。評(píng)判飲料穩(wěn)定性的指標(biāo)和方法如下：

（1）粒徑

用Malvern Zetasizer Nano 900粒徑電位分析儀測(cè)定粒徑的分布情況，測(cè)試的參數(shù)為：水的折光指數(shù)為1.33，蛋白質(zhì)的折光指數(shù)為1.529，吸光度值為0，測(cè)試溫度為恒溫25 ℃。樣品用超純水稀釋100倍后，過0.45 μm聚丙烯有機(jī)濾膜后使用。

（2）zeta電位

用Malvern Zetasizer Nano 900粒徑電位分析儀測(cè)定飲料體系中zeta-電位。測(cè)試的參數(shù)為：水的折光指數(shù)為1.33，蛋白質(zhì)的折光指數(shù)為1.529，吸光度值為0，測(cè)試溫度為恒溫25 ℃。樣品用超純水稀釋100倍后，過0.45 μm聚丙烯有機(jī)濾膜后使用。

（3）離心沉淀率

在有刻度的離心管中倒入10 mL左右的乳飲料，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取出后棄去上層溶液，倒置靜置10 min后，準(zhǔn)確稱取沉淀質(zhì)量，計(jì)算沉淀離心率，其計(jì)算公式如下：

（4）不穩(wěn)定性指數(shù)

將平衡后的樣品加入Lumisizer專用樣品池中，進(jìn)行檢測(cè)，條件為曲線個(gè)數(shù)255，轉(zhuǎn)速4 000 r/min，時(shí)間間隔為30 s。檢測(cè)完畢使用Lumisizer專用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用Microsoft Excel 2016、Origin 8.5等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖；IMB SPSS Statistics 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐變時(shí)間、均質(zhì)壓力、果膠用量對(duì)褐色乳酸菌飲料穩(wěn)定性的影響

2.1.1 褐變時(shí)間的影響

由圖1可知，隨著褐變時(shí)間從120 min增加至160 min，飲料生產(chǎn)過程各工藝階段物料的不穩(wěn)定指數(shù)下降，表明產(chǎn)品穩(wěn)定性隨著褐變過程美拉德反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而依次變好。當(dāng)褐變時(shí)間從160 min增加至170 min時(shí)，物料在褐變后不同工藝階段的不穩(wěn)定指數(shù)升高，其變化曲線位于150 min和160 min的曲線之間，表明體系變得不穩(wěn)定。在高溫褐變過程中，蛋白質(zhì)與乳糖、葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，蛋白質(zhì)的糖基化可以改善其功能性質(zhì)，如起泡性、乳化性、溶解性、熱穩(wěn)定性等。褐變時(shí)間過短時(shí)，只有部分蛋白質(zhì)發(fā)生了褐變，顏色較淺，產(chǎn)品風(fēng)味不足[12]。因此蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)在一定范圍內(nèi)隨美拉德反應(yīng)的進(jìn)行而逐步增強(qiáng)，從而提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性[13]。但是當(dāng)褐變時(shí)間超出一定范圍時(shí)，如本實(shí)驗(yàn)的160 min，產(chǎn)品穩(wěn)定性開始下降，這是由于過度美拉德反應(yīng)可能給體系帶來(lái)更加復(fù)雜的化學(xué)組成，除了蛋白糖基化反應(yīng)，還有其他非蛋白的聚合反應(yīng)可能導(dǎo)致沉淀的發(fā)生。此外高溫長(zhǎng)時(shí)間熱處理使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)變性后發(fā)生聚集和交聯(lián)使蛋白質(zhì)顆粒體積變大，產(chǎn)品穩(wěn)定性下降[14-15]。因此，最佳褐變時(shí)間確定為160 min。

圖1 不同褐變時(shí)間對(duì)飲料生產(chǎn)過程不穩(wěn)定指數(shù)變化的影響Fig.1 Effect of different browning time on instability indexes changes of beverage during the production process

2.1.2 均質(zhì)壓力的影響

由圖2可知，隨著均質(zhì)壓力從15 MPa增大至25 MPa，不同實(shí)驗(yàn)組在配料定容后的均質(zhì)處理使物料的不穩(wěn)定指數(shù)降低，體系穩(wěn)定性提高；當(dāng)均質(zhì)壓力進(jìn)一步從25 MPa增加至40 MPa時(shí)，不穩(wěn)定指數(shù)逐步升高，表明過度均質(zhì)使體系變得更不穩(wěn)定。在均質(zhì)過程中，均質(zhì)壓力過小，形成的蛋白質(zhì)顆粒就較大。根據(jù)斯托克斯定律，蛋白質(zhì)分子的沉降速度與其粒子半徑成正比，蛋白質(zhì)分子半徑越小，其沉降速度越慢，褐色乳酸菌飲料的穩(wěn)定性越好[16]。而均質(zhì)壓力過大時(shí)形成的蛋白質(zhì)粒徑太小，一方面導(dǎo)致分子布朗運(yùn)動(dòng)加快，碰撞頻率增加，另一方面表面電荷減少，電荷排斥作用降低，蛋白質(zhì)容易聚集，產(chǎn)品穩(wěn)定性下降。杜柏橋[17]研究表明，當(dāng)均質(zhì)壓力在5～30 MPa時(shí)，隨著均質(zhì)壓力的增大，蛋白質(zhì)粒徑減小；但均質(zhì)壓力高于30 MPa，穩(wěn)定劑和蛋白質(zhì)不能很好結(jié)合，體系黏度降低，產(chǎn)品穩(wěn)定性降低，這與本研究結(jié)果一致。因此，確定最佳均質(zhì)壓力為25 MPa。

圖2 不同均質(zhì)壓力對(duì)飲料生產(chǎn)過程不穩(wěn)定指數(shù)變化的影響Fig.2 Effect of different homogenization pressures on instability indexes changes of beverage during the production process

2.1.3 果膠添加量的影響

果膠分子中存在極性和非極性區(qū)域使果膠具有穩(wěn)定性、增稠性、凝膠性等作用，在食品行業(yè)廣泛應(yīng)用，酸性乳飲料中應(yīng)用的果膠均為高甲氧基果膠[18]。由圖3可知，果膠用量在1.0～3.5 g/L范圍內(nèi)增加時(shí)，配料后各工藝階段物料的不穩(wěn)定指數(shù)呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢(shì)，果膠用量為2.5 g/L時(shí)達(dá)到最低值，表明此時(shí)果膠可能已經(jīng)完全與蛋白質(zhì)分子發(fā)生作用，體系達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。在酸性條件下果膠上的-COOH負(fù)電荷和酪蛋白上的-NH2負(fù)電荷之間具有穩(wěn)定的靜電相互作用[19]，使酪蛋白微粒被帶負(fù)電荷的果膠分子包圍而帶上大量負(fù)電荷[20]；此外由于果膠的高度水化作用，果膠吸附在蛋白質(zhì)分子表面后形成膠體保護(hù)層，導(dǎo)致蛋白顆粒相互排斥并阻止蛋白質(zhì)分子的脫水；在電荷排斥和水化膜共同作用下使酪蛋白膠束顆粒得以穩(wěn)定地分散在體系中[21]。SEDLMEYER F等[22-23]研究表明，果膠吸附到蛋白質(zhì)顆粒上形成空間位阻防止蛋白質(zhì)顆粒進(jìn)行絮凝，酪蛋白與果膠形成的弱混合物對(duì)穩(wěn)定產(chǎn)品體系有重要作用。果膠用量＞2.5 g/L時(shí)，產(chǎn)品不穩(wěn)定指數(shù)增加，這可能是因果膠已經(jīng)完全與蛋白質(zhì)分子發(fā)生作用，過量的果膠分子間相互作用影響穩(wěn)定性。因此，確定最佳果膠用量為2.5 g/L。

圖3 不同果膠用量對(duì)飲料生產(chǎn)過程不穩(wěn)定指數(shù)變化的影響Fig.3 Effect of different pectin dosages on instability index changes of beverage during the production

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化褐色乳酸菌飲料生產(chǎn)工藝

2.2.1 基于粒徑測(cè)定的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，果膠用量對(duì)粒徑的影響最大，均質(zhì)壓力次之，最后是褐變時(shí)間；優(yōu)化條件組合為A3B1C3，即褐變時(shí)間為165 min，均質(zhì)壓力為22 MPa，果膠用量為2.8 g/L；此條件下產(chǎn)品的粒徑最?。?23 nm），產(chǎn)品體系較穩(wěn)定。

表2 基于粒徑測(cè)定的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal tests based on particle size

2.2.2 基于zeta電位測(cè)定的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，果膠用量對(duì)zeta電位的影響最大，均質(zhì)壓力次之，最后是褐變時(shí)間；優(yōu)化條件組合為A3B1C3，即褐變時(shí)間為165 min，均質(zhì)壓力為22 MPa，果膠用量為2.8 g/L；此條件下產(chǎn)品的電位絕對(duì)值最大（-4.88 mV），體系整體電荷總量大，靜電斥力有助于離子相互排斥，避免了顆粒碰撞而聚沉，產(chǎn)品穩(wěn)定性較好。

表3 基于電位測(cè)定的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal tests based on zeta potential

2.2.3 基于離心沉淀率測(cè)定的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，果膠用量對(duì)離心沉淀率的影響最大，均質(zhì)壓力次之，最后是褐變時(shí)間；優(yōu)化條件組合為A3B1C1，即褐變時(shí)間為165 min，均質(zhì)壓力為22 MPa，果膠用量為2 g/L；此條件下產(chǎn)品的離心沉淀率最?。?.71%），最穩(wěn)定。

表4 基于離心沉淀率測(cè)定的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal tests based on centrifugal precipitation rate

2.2.4 基于不穩(wěn)定指數(shù)測(cè)定的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，果膠用量對(duì)不穩(wěn)定指數(shù)的影響最大，均質(zhì)壓力次之，最后是褐變時(shí)間；優(yōu)化條件組合為A3B1C1，即褐變時(shí)間為165 min，均質(zhì)壓力為22 MPa，果膠用量為2.0 g/L；此條件下產(chǎn)品的不穩(wěn)定指數(shù)最小（0.737），產(chǎn)品體系穩(wěn)定。

表5 基于不穩(wěn)定指數(shù)測(cè)定的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of orthogonal tests based on instability index

從粒徑、電位角度出發(fā)，最優(yōu)的工藝條件組合為A3B1C3；從離心沉淀率和不穩(wěn)定指數(shù)出發(fā)，最優(yōu)工藝條件組合為A3B1C1，且2.0 g/L和2.8 g/L條件下的離心沉淀率、不穩(wěn)定指數(shù)的均值都相差不大?？紤]到果膠用量是影響最大的因素，且果膠用量為2.8 g/L時(shí)的產(chǎn)品粒徑和電位都好于2.0 g/L，因此選擇最優(yōu)工藝條件組合為A3B1C3，即褐變時(shí)間、均質(zhì)壓力和果膠用量分別為165 min、22 MPa和2.8 g/L。

3 結(jié)論

通過對(duì)殺菌型褐色乳酸菌飲料生產(chǎn)過程中與產(chǎn)品穩(wěn)定性密切相關(guān)的3個(gè)因素即褐變時(shí)間、均質(zhì)壓力和果膠用量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果表明，當(dāng)褐變時(shí)間為160 min、均質(zhì)壓力25 MPa、果膠添加量2.5 g/L時(shí)，體系的不穩(wěn)定指數(shù)值最小。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步以褐變時(shí)間、均質(zhì)壓力、果膠用量為自變量，以粒徑、zeta電位、離心沉淀率和不穩(wěn)定指數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果表明，果膠用量對(duì)產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響最大，其次是均質(zhì)壓力，最后是褐變時(shí)間；因此選用最優(yōu)工藝條件組合為A3B1C3，即褐變時(shí)間、均質(zhì)壓力和果膠用量分別為165 min、22 MPa和2.8 g/L。本研究結(jié)果為進(jìn)一步改進(jìn)褐色乳酸菌飲料生產(chǎn)工藝及提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性奠定技術(shù)基礎(chǔ)。