解毒生肌膏對糖尿病潰瘍皮膚微生態(tài)平衡的作用機制

陳 麗，廖亮英，戴飛躍，王 瑜，張 揚，陳敏敏，黃潔雅，葉永鑫，周忠志*

（1.湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙 410007）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種由多病因引起的以血糖慢性升高為主要特征的終身性代謝性疾病，皮膚潰瘍是其常見并發(fā)癥之一[1-2]。近年來，微生態(tài)研究受到大量學者關(guān)注，它是指在一定組織內(nèi)，微生物群在此進行物質(zhì)交換、能量傳遞及信息交流的統(tǒng)一系統(tǒng)[3-4]。在糖尿病潰瘍發(fā)生發(fā)展中，皮膚創(chuàng)面微環(huán)境也隨之發(fā)生改變，為潰瘍創(chuàng)面的轉(zhuǎn)歸提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)，在其中扮演了重要角色，影響糖尿病潰瘍愈合[5-6]。因此，我們嘗試從穩(wěn)定創(chuàng)面微環(huán)境去研究促進糖尿病潰瘍愈合的治療方法。

解毒生肌膏是由全蝎、蜈蚣、乳香、沒藥按君臣佐使原則配伍制成，是指導老師在臨床治療糖尿病潰瘍的有效經(jīng)驗方。本課題通過制備2 型糖尿病皮膚潰瘍大鼠模型[7]，采用肉眼觀察、Masson 染色法等方法觀察創(chuàng)面愈合情況及鏡下形態(tài)學，探究解毒生肌膏對糖尿病潰瘍皮膚微生態(tài)平衡的影響。

1 實驗材料

健康雄性SD 大鼠（SPF 級）30 只，4～6 周齡，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司供給；實驗操作過程中對動物的處置符合2009年《Ethical Issues in Animal Experimentation》中關(guān)于動物倫理學標準的條例。飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級。室溫保持在20～25 ℃，濕度保持在45%～75%。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5 只大鼠。實驗期間飼以大鼠標準飼料，自由飲水、飲食，每天補充1 次水和飼料，每2 d 更換1 次墊料，并清洗、消毒籠具。解毒生肌膏，從湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院購買全蝎、蜈蚣、乳香和沒藥，按一定比例混合磨碎加工制成，實驗全過程使用同種藥物；銀鋅皮膚黏膜抑菌霜，珠海億勝生物制藥有限公司（S2004000）；水合氯醛,天津市科密歐化學試劑有限公司（CAS：302-17-0）；鏈脲佐菌素（STZ），sigma-aldrich 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；檸檬酸鈉緩沖液（Solabio Cat#C1013），北京索萊寶科技有限公司；高脂乳劑原料：丙硫氧嘧啶，源葉生物（530643）；膽酸鈉（豬），源葉生物（S30219）；1,2-丙二醇，湖南省天虹試劑有限公司；吐溫-80，天津市科密歐化學試劑有限公司；食用豬油（QS430102030013）；4%多聚甲醛,長沙市開福區(qū)灝揚生物試劑經(jīng)營部（AR1068）；精密pH 試紙，上海三愛思試劑有限公司（2190215）；LFT-1 紅外線敏感溫度計，20106800025812。

2 實驗方法

2.1 模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，用高脂乳劑于每天同一時間段以2 mL/只的劑量連續(xù)灌胃14 d[8]；采用隨機數(shù)表法將30 只大鼠隨機分為模型組（10 只）、解毒生肌膏組（10只）、銀鋅皮膚黏膜抑菌霜組（10只）。3 組均以40 mg/kg 的劑量腹腔注射STZ 建立糖尿病模型[9]，在造模前和造模3 d后采用剪尾法測量隨機血糖，之后禁食不禁水12 h 測量空腹血糖，采用電子秤每周稱得大鼠平均體質(zhì)量。造模成功標準：造模前隨機血糖＜8.9 mmol/L，造模后隨機血糖≥16.7 mmol/L，空腹血糖≥11.1 mmol/L，大鼠體質(zhì)量明顯下降。繼而參照趙京禹[10]、李友山[11]等方法制備糖尿病創(chuàng)面模型：采用10%水合氯醛3.5 mL/kg 腹腔注射將大鼠麻醉，呈腹臥位固定，背部脫毛，用絡(luò)合碘與乙醇消毒處理后在大鼠背部以脊柱為軸在肩胛骨下緣約2 cm 處左右對稱創(chuàng)設(shè)2 個直徑為1.5 cm 的圓形全層皮膚缺損區(qū)域，深至筋膜，即成功建立2 型糖尿病大鼠背部全層皮膚缺損模型。

2.2 干預方法 將造模成功的大鼠按照組別分別給予以下處理：模型組不做任何處理，解毒生肌膏組于創(chuàng)面均勻涂抹復方解毒生肌膏藥物，銀鋅皮膚黏膜抑菌霜組于創(chuàng)面均勻涂抹銀鋅皮膚黏膜抑菌霜試劑。并對3 組大鼠每天進行換藥觀察處理直至處死，分籠飼養(yǎng)大鼠并自由飲食。

2.3 標本采集 各組分別于建立2 型糖尿病大鼠背部全層皮膚缺損模型后3、7、14、21 d，取4 個時間點造模的大鼠，用10%水合氯醛麻醉，對創(chuàng)面進行拍照記錄。繼而以創(chuàng)面為中心取得大小為2 cm ×2 cm 的標本，于4%多聚甲醛瓶中固定，常溫保存，制成組織形態(tài)病理切片，用Masson 染色觀察細胞和組織形態(tài)進行組織學分析。

2.4 指標檢測 宏觀觀察并記錄3 組大鼠不同時間點的愈合情況，利用Image J 計算出各時間點大鼠背部創(chuàng)面愈合面積，創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)傷面積-檢查時傷口面積）/原始創(chuàng)傷面積×100%。

將固定在4%多聚甲醛中的標本送至湖南中醫(yī)藥大學顯微形態(tài)實驗室，經(jīng)75%、85%、90%、95%Ⅰ、Ⅱ濃度梯度乙醇及無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脫水，放入二甲苯透明，浸蠟包埋，切片機（廠家：LEICA;型號：RM2235）進行切片，37 ℃攤片，撈片，按順序裝籃，60 ℃的恒溫箱內(nèi)烤片，烤片2 h。

將石蠟標本制成5 μm 厚的切片，常規(guī)Masson 染色光學顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織炎性反應(yīng)、膠原改變、壞死組織存留及脫落、新生上皮生長等形態(tài)學變化。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料滿足正態(tài)性及方差齊性以均數(shù)±標準差（）表示，否則使用中位數(shù)及四分位間距M（P25,P75）表述，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 檢驗。

3 結(jié)果

3.1 肉眼觀察情況 模型組：造模后1 h 創(chuàng)面分泌物較多，創(chuàng)面濕潤，創(chuàng)緣略顯腫脹；造模后3 d 創(chuàng)面有少量膿點并有較多分泌物，創(chuàng)緣明顯腫脹，可見新生肉芽組織；造模后7 d 創(chuàng)面無明顯膿性分泌物，創(chuàng)緣開始收斂，創(chuàng)口面積略減??；造模后14 d 創(chuàng)面雖仍未完全愈合，但創(chuàng)緣明顯收縮，創(chuàng)面存在痂皮；造模后21 d 部分痂皮脫落，創(chuàng)面呈愈合趨勢。結(jié)果見圖1。

解毒生肌膏組：與模型組相比，造模后1 d 創(chuàng)面較干燥，創(chuàng)緣腫脹輕微；造模后3 d 創(chuàng)面分泌物較少，創(chuàng)緣腫脹明顯，可見新生肉芽組織；造模后7 d 創(chuàng)面面積有較為明顯的收縮，創(chuàng)面干燥，有大量肉芽組織生成；造模后14 d 創(chuàng)面覆蓋有薄層痂膜，創(chuàng)緣明顯收縮；造模后21 d痂皮脫落，基本完全愈合。結(jié)果見圖1。

銀鋅皮膚黏膜抑菌霜組見圖1：根據(jù)各個時間段愈合情況與解毒生肌膏組相比，造模后3 d 從創(chuàng)面愈合情況來看，解毒生肌膏組的創(chuàng)面較為腫脹，總體來說解毒生肌膏對創(chuàng)面的愈合效果較銀鋅皮膚黏膜抑菌霜組好。結(jié)果見圖1。

3.2 創(chuàng)面愈合率比較 與模型組比較，解毒生肌膏組與銀鋅皮膚黏膜抑菌霜組在造模后3 d 到7 d 創(chuàng)面面積均縮小，造模后7 d縮小更顯著，且具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），陽性對照組比模型組的愈合率小。見表1。

表1 3 組創(chuàng)面愈合率比較（，n=20） %

表1 3 組創(chuàng)面愈合率比較（，n=20） %

注：與模型組比較，# P ＜0.05

3.3 Masson 染色情況 造模后3 d：模型組炎癥細胞浸潤也較少，新生肉芽組織較少，膠原纖維少且排列紊亂，見圖2-ABC；解毒生肌膏組創(chuàng)面可見炎癥細胞浸潤較多，新生肉芽組織較多，見圖2-DEF；銀鋅皮膚黏膜抑菌霜組也有較多的炎癥細胞，新生的肉芽組織較多，膠原纖維較多，見圖2-GHI。造模后7 d：模型組炎癥細胞浸潤明顯增多，肉芽組織生成增加，但是比解毒生肌膏組少，見圖3-ABC；解毒生肌膏組炎癥細胞浸潤減少，新生肉芽組織增多，膠原纖維較多且排列緊密，出現(xiàn)小動脈，且成纖維細胞也較多，見圖3-DEF；銀鋅皮膚黏膜抑菌霜組炎癥細胞較多，新生肉芽組織較多，膠原排列較為整齊，見圖3-GHI。

3.4 創(chuàng)面pH 值測定結(jié)果 由于實驗后期創(chuàng)面有痂膜生成，無法直接測得創(chuàng)面及分泌物pH 值，所以pH 值檢測時間點為3、7、10 d，檢測結(jié)果顯示：3、7 d 時間點解毒生肌膏組創(chuàng)面pH 值低于模型組和銀鋅皮膚黏膜抑菌霜組；10 d 時間點解毒生肌膏組pH 值高于模型組和銀鋅皮膚黏膜抑菌霜組。其中，與模型組比較，解毒生肌膏組在7 d 時間點時pH 值低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

3.5 創(chuàng)面溫度測定結(jié)果 創(chuàng)面溫度測定結(jié)果顯示，解毒生肌膏組和模型組、銀鋅皮膚黏膜抑菌霜組之間在每個時間點的創(chuàng)面溫度差別不大，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

圖2 3 d 時間點3 組創(chuàng)面形態(tài)學（Masson 染色）

圖3 7 d 時間點3 組創(chuàng)面形態(tài)學（Masson 染色）

表2 3 組創(chuàng)面pH 值

表3 3 組創(chuàng)面溫度測定結(jié)果 （°）

4 討論

糖尿病潰瘍是糖尿病嚴重的并發(fā)癥之一，是臨床常見的慢性難愈性創(chuàng)面，具有病程長、復發(fā)率高、易感染、易致截肢或引發(fā)膿毒血癥等特點，極其影響人類健康，并帶來嚴重的經(jīng)濟負擔和社會負擔[12-13]，其愈合過程受多細胞、多因子的影響，其中微生態(tài)的變化在糖尿病潰瘍的治愈中扮演尤為重要的角色。

皮膚微生態(tài)是由皮膚所含微生物、宿主皮膚與內(nèi)外環(huán)境構(gòu)成的整體，它們相互協(xié)調(diào)，保持動態(tài)平衡[14]，而糖尿病潰瘍即一個由龐大、復雜的微生物群構(gòu)成的微生態(tài)環(huán)境?，F(xiàn)代研究表明[15-16]，高糖環(huán)境可能導致微生態(tài)中的溫度、pH 值、免疫功能等物理、化學、生物因素紊亂，打破其動態(tài)平衡，從而造成創(chuàng)面長期難以愈合。因此在治療中，如何恢復糖尿病潰瘍微生態(tài)中的平衡，達到治愈糖尿病潰瘍的目的，應(yīng)引起足夠的重視。

解毒生肌膏是由全蝎、蜈蚣、乳香、沒藥按君臣佐使原則配伍制成，具有解毒祛瘀生肌之功效。本實驗通過構(gòu)建大鼠背部全層皮膚缺損模型，設(shè)立模型組、解毒生肌膏組和銀鋅皮膚黏膜抑菌霜組。肉眼觀察用藥前后及不同組別潰瘍的創(chuàng)面面積、肉芽組織生長情況、創(chuàng)周水腫、膿液分泌等情況，發(fā)現(xiàn)解毒生肌膏組于造模后3、7 d 創(chuàng)面愈合速率明顯增快、質(zhì)量明顯高。Masson 染色表明：造模后3 d，解毒生肌膏組較其他組新生表皮更長，膠原、肉芽組織豐富，大量炎細胞浸潤，炎癥期反應(yīng)明顯加強；造模后7 d，模型組和銀鋅皮膚黏膜抑菌霜組膠原、肉芽組織有所增多，炎細胞浸潤較解毒生肌膏組明顯，炎癥期反應(yīng)強于同期解毒生肌膏組和該組3 d 時反應(yīng)程度。以上結(jié)果說明解毒生肌膏可改善創(chuàng)面微生態(tài)從而促進糖尿病潰瘍愈合。

以往研究表明，創(chuàng)面的酸堿度對潰瘍的影響無統(tǒng)一定論[17-18]，糖尿病潰瘍患者由于體內(nèi)呈高糖狀態(tài)，致代謝改變，免疫障礙，從而直接影響細胞生長因子以及細胞促炎因子的分泌，使?jié)兙植课h(huán)境缺血缺氧，pH 值降低，抑制成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞增值遷移減少，致潰瘍愈合困難[19-20]。本實驗研究表明，解毒生肌膏可使創(chuàng)面pH 值在造模后趨于正常，形成較合適的化學環(huán)境，加速潰瘍愈合。

物理因素——創(chuàng)面的溫度，既往研究也尚無意義[21]，本次實驗也驗證了這一點，由此猜想雖然理論上降低炎癥反應(yīng)會使創(chuàng)面溫度也降低，但是由于糖尿病潰瘍的發(fā)生已屬于晚期并發(fā)癥，解毒生肌膏即便減輕炎癥反應(yīng)，而對于溫度改變并不大。

本實驗通過建立糖尿病大鼠全層皮膚缺損模型，觀察皮膚潰瘍?nèi)庋奂扮R下愈合情況、測量創(chuàng)面pH 值，證實中藥解毒生肌膏可通過調(diào)節(jié)創(chuàng)面pH值趨向正常，抑制創(chuàng)面炎癥狀態(tài)以改善創(chuàng)面微生態(tài)從而促進糖尿病皮膚潰瘍的愈合，但其能否影響整個皮膚創(chuàng)面微環(huán)境包括物理、化學、生物因素，從而促進潰瘍愈合還需進一步研究。