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    瀉痢康腸溶膠囊微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)研究

    2021-03-11 03:52:42孫曉朋
    黑龍江醫(yī)藥 2021年3期
    關(guān)鍵詞:適用性菌液埃希菌

    孫曉朋,曹 瑩,王 萌

    鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所藥理室,河南 鄭州 450000

    瀉痢康腸溶膠囊是療效非常好的一味醫(yī)院制劑。其含有五倍子、麩煨肉豆蔻、白鮮皮、枯礬、大蒜和醋艾炭這六味中藥飲片。其中的五倍子有抗菌解毒等多種生物學(xué)功能[1-2]。 白鮮皮對廣譜的真菌有抑制作用[3-4]??莸\對大腸桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌等都有明顯的抑菌作用[5]。大蒜是天然的植物廣譜抗菌素[6],大蒜素的殺菌能力是青霉素的十分之一[7],對多種細(xì)菌、真菌均有抑制和殺滅作用,是當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的天然植物中抗菌作用最強(qiáng)的一種[8]。綜上所述,瀉痢康腸溶膠囊的抑菌性非常強(qiáng)。《中國藥典》2015年版四部規(guī)定,應(yīng)先消除供試品的抑菌活性,才能依法檢查。因此本文依據(jù)四部通則1105、1106、1107具體規(guī)則作為檢測依據(jù),選擇適當(dāng)?shù)臋z查方法,建立該藥的微生物限度的檢查方法。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    (1)選擇儀器:超凈工作臺(JB-CJ-2FC 蘇州佳寶凈化),生物安全柜(LA2-4A1 新加坡藝思高),電熱恒溫培養(yǎng)箱(HH-B11 500BS 上海躍進(jìn))、霉菌培養(yǎng)箱(MJP-250上海精宏),隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9160上海精宏),蒸汽滅菌器(SX-700,日本TOMMY公司)。(2)試藥:瀉痢康腸溶膠囊,規(guī)格:每粒裝0.4 g,批號:190402、190421、190422。(3)適用性檢查用培養(yǎng)基:胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA,批號:20190515)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA,批號:20190103)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB,批號:20190305)、麥康凱液體培養(yǎng)基(Mac,批號:20190226)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MacA,批號:20190123)、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基(EE,批號:20190218)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(VRBA,批號:20190105)、RV 沙門增菌液體培養(yǎng)基(RV,批號:20190312)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(XLD,批號:20190301)以上均購于青島海博。(4)菌種:金黃色葡萄球菌〔CMCC(B)26 003〕、銅綠假單胞菌〔CMCC(B)10 104〕、枯草芽孢桿菌〔CMCC(B)63 501〕、白色念珠菌〔CMCC(F)98 001〕、 黑曲霉〔CMCC(F)98 003〕、大腸埃希菌〔CMCC(B)44 102〕,乙型副傷寒沙門菌〔CMCC(B)50094〕,以上均購于中國食品藥品檢定研究院,菌株傳代次數(shù)均為3代。

    1.2 方法

    (1)菌液制備: 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌的新鮮培養(yǎng)物至100 ml TSB 中,33℃培養(yǎng)20 h,并稀釋成濃度適宜的菌懸液。 接種枯草芽孢桿菌的TSA 斜面培養(yǎng)物至盛有TSA 的茄形培養(yǎng)瓶內(nèi),在斜面上均勻涂布,33℃培養(yǎng)7 日,用滅菌水100 ml 分次將芽孢洗下,65℃水浴中加熱30 min,并稀釋成濃度適宜的菌懸液。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至100 ml SDB 中,25℃培養(yǎng)48 h,并稀釋成濃度適宜的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至SDA上,23℃培養(yǎng)7天,用0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫制成適宜濃度的菌懸液。(2)計(jì)數(shù)方法的適用性試驗(yàn)(回收試驗(yàn)):供試品溶液的制備:取供試品10 g,加pH6.8 無菌磷酸鹽緩沖溶液至100 ml,置45℃水浴中,搖勻,即為1:10 的溶液,同時(shí)制備1:100,1:1000的供試品溶液。試驗(yàn)組(供試品溶液+菌液):需氧菌計(jì)數(shù)(供試品溶液稀釋法):取1∶1000的供試品溶液9.9 ml、5 份,分別加入各試驗(yàn)菌液0.1 ml,混勻,使1.0 ml 供試品溶液中含菌量不大于100 cfu。分別取3.0 ml加菌后的供試品溶液,等量分注3個(gè)平皿內(nèi),傾注TSA,培養(yǎng)。 霉菌及酵母菌檢查(供試品溶液稀釋法):取1∶100供試品溶液9.9 ml、2份,分別加入各試驗(yàn)菌液0.1 ml,使1.0 ml 供試品溶液中含菌量不大于100 cfu。分別取3.0ml 加菌后的供試品溶液,等量分注3 個(gè)平皿內(nèi),傾注SDA,培養(yǎng)。供試品對照組(測供試品本底菌數(shù)):取1:1000、1:100的供試液,以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。菌液對照組(測定所加的試驗(yàn)菌數(shù));取各菌懸液0.1 ml,分別注入平皿中,每種試驗(yàn)菌平行制備3個(gè)平皿。

    2 結(jié)果

    由表1 看出,需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)與霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)法中試驗(yàn)菌種的回收比值均在0.5~2.0的范圍內(nèi)。

    表1 需氧菌、霉菌及酵母菌回收率測定結(jié)果

    2.1 控制菌檢查方法的適用性試驗(yàn)

    供試品溶液制備;取計(jì)數(shù)方法適用性項(xiàng)下制備的1:10溶液,用于控制菌檢查方法適用性的驗(yàn)證。

    2.2 大腸埃希菌檢查方法的適用性試驗(yàn)

    (1)增菌培養(yǎng): 取1:10的供試品溶液10 ml及大腸埃希菌菌液(不大于100 cfu),加入100 ml TSB 中,培養(yǎng)18 h。(2)選擇和分離培養(yǎng):取上述TSB 培養(yǎng)液1 ml,接種至100 mlMac 中,43℃培養(yǎng)24 h。取Mac 培養(yǎng)物劃線接種于MacA上,33℃培養(yǎng)18 h,觀察,見表2。

    表2 大腸埃希菌檢查方法的適用性試驗(yàn)結(jié)果

    2.3 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法的適用性試驗(yàn)

    (1)預(yù)培養(yǎng): 取供試品10 g,加TSB 至100 ml,搖勻,在22℃培養(yǎng)2 小時(shí)。(2)選擇和分離培養(yǎng):取1:10 的供試品溶液預(yù)培養(yǎng)液2 ml,分別接種至2 支15 ml 的EE 中,其中一支加入大腸埃希菌菌懸液(不大于100 cfu),另一支加入銅綠假單胞菌菌懸液(不大于100 cfu),33℃培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)液分別劃線接種于VRBA 上,33℃培養(yǎng)18 h,觀察,見表3。

    表3 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法的適用性試驗(yàn)結(jié)果

    2.4 沙門菌檢查方法的適用性試驗(yàn)

    (1)增菌培養(yǎng):取供試品10 g 及乙型副傷寒沙門菌菌液( 不大于100 cfu),加入200 ml TSB 中,培養(yǎng)18 h。(2)選擇和分離培養(yǎng);取上述TSB 培養(yǎng)液0.1 ml,接種至10 mlRV中,33℃培養(yǎng)18 h。取少量RV培養(yǎng)物劃線接種于XLD上,33℃培養(yǎng)18 h,觀察,見表4。

    表4 沙門菌檢查方法的適用性試驗(yàn)結(jié)果

    3 討論

    該藥主要由植物的根、皮、動(dòng)物及礦物組成,本來微生物污染情況就不容易控制,同時(shí)又因?yàn)樵撍幹泻形灞蹲?、白鮮皮、枯礬、大蒜等這些抑菌性很強(qiáng)的中藥飲片,而微生物限度檢查計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)和控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)需要在藥物抑菌作用盡可能被降低或者說是達(dá)到無抑菌的條件下進(jìn)行,這給試驗(yàn)帶來很大困難。當(dāng)然采用薄膜過濾法是比較經(jīng)典的去除抑菌性的一個(gè)非常有效的方法,但是我們此次試驗(yàn)的對象是中成藥,無法像化學(xué)藥一樣在合適的稀釋液中溶解或均勻分散,因此在最開始的取樣環(huán)節(jié)就帶來很大的困難。比如取樣的時(shí)候如果只取上清液,會造成取樣不均衡,結(jié)果不具有代表性;即使是充分混勻后快速取樣,藥物殘?jiān)鼤氯麨V膜,給過濾帶來很大的困難。即使是完成過濾,在培養(yǎng)觀察的時(shí)候,由于藥物殘?jiān)街跒V膜上,菌落生長情況也非常不容易觀察,不利于后續(xù)結(jié)果準(zhǔn)確性的保證。因此,稀釋供試品溶液和增加培養(yǎng)基體積的方法,是最好的選擇。

    本研究經(jīng)過適用性試驗(yàn),建立了瀉痢康腸溶膠囊的微生物限度檢查方法,最終得出結(jié)論:需氧菌總數(shù)和霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)法采用的是供試品溶液稀釋法,需氧菌總數(shù)檢查時(shí),供試品稀釋到10-3,霉菌和酵母菌總數(shù)檢查時(shí),供試品稀釋到10-2;大腸埃希菌采用的是常規(guī)法;耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌采用的是增加培養(yǎng)基體積的方法,耐膽鹽革蘭陰性菌檢查時(shí),培養(yǎng)基體積增加至15 ml,沙門菌檢查時(shí),培養(yǎng)基體積增加至200 ml。采用上述方法,回收比值均在0.5~2范圍內(nèi),該方法成立。

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