茶菊品種‘14-C-1’的CmF3H基因及啟動(dòng)子克隆與表達(dá)分析

曹世哲，羅 昌，陳東亮，劉 華，程 曦，黃叢林*

(1 北京農(nóng)學(xué)院 園林學(xué)院，北京 102206；2 北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097；3 北京市功能花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100097)

菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat)為菊科菊屬宿根草本花卉，不僅是重要的觀賞植物，而且是非常重要的食用、茶用和藥用植物。目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了菊花中含有多種藥理和生物活性成分。其中，黃酮類化合物(flavonoids)是最重要的活性成分。黃酮類化合物別名類黃酮，是植物中一類對(duì)人類健康有重要價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物，具有多種生物活性和藥用功效，如抗炎、抗氧化、抗癌、降血壓、降血糖、保護(hù)神經(jīng)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等[1]。此外，黃酮類化合物還在植物自身生理生化過程中發(fā)揮重要作用，如對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起到控制調(diào)節(jié)作用，保護(hù)植物組織免受紫外線傷害、花的著色和種間相互作用的信號(hào)傳導(dǎo)，還能抵抗外界非生物脅迫以及昆蟲侵襲等[2-3]。目前已知的黃酮類化合物超過1萬種[4]，根據(jù)其基本分子結(jié)構(gòu)的雜氧環(huán)和構(gòu)象的不同，一般可劃分為黃烷酮(falvanone)、黃酮(flavones)、異黃酮(isoflavones)、黃酮醇(flavonols)、黃烷醇(flavanols)和花色素(anthoyanidins)六大類[5]。黃酮類化合物是由一系列酶催化而合成的2-苯基色原酮衍生物。

黃烷酮3-羥化酶(Flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H)屬于2-O-酮戊二酸和鐵離子依賴的雙加氧酶超家族(2-ODD)，是黃酮類化合物合成途徑分支點(diǎn)的一個(gè)核心酶，可將黃烷酮類底物還原為二氫黃酮醇類化合物，而二氫黃酮醇類化合物是合成黃酮醇和無色花色素類物質(zhì)的前體物質(zhì)[6-7]，從而F3H可間接調(diào)控黃酮醇、黃烷醇和花青素等黃酮類物質(zhì)的合成，最終影響植物中黃酮類物質(zhì)含量和植物花色[8]。第一次關(guān)于F3H活性的研究是在紫羅蘭(Matthiolaincana)中報(bào)道的，但因?yàn)槊富钚缘?、不穩(wěn)定，從紫羅蘭中純化該酶并沒有成功。F3H的第一次成功純化及鑒定是Britsch等[9]在矮牽牛(Petuniahybrida)的紅花突變體中進(jìn)行的。

F3H基因最早由Martin等[10]從金魚草(AntirrhinummajusL)中分離得到，此后，研究人員陸續(xù)從銀杏(Ginkgobiloba)、玉米(Zeamays)、茶樹(Camelliasinensis)等植物中克隆并鑒定了F3H基因。目前關(guān)于F3H基因的深入研究，大部分集中在其色素生物合成功能方面。F3H基因在花青素合成過程中發(fā)揮著重要作用，Wisman等[11]在擬南芥中阻斷F3H基因的表達(dá)，導(dǎo)致擬南芥植株體內(nèi)黃酮及花色素等含量變低；Jiang等[12]利用RNA干擾技術(shù)使草莓(Fragaria×ananassaDuch)中F3H基因沉默，液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果顯示草莓果實(shí)中花青素含量顯著降低。由此可見，F(xiàn)3H基因在植物花色素等黃酮類化合物合成途徑中具有重要作用。目前，關(guān)于茶用菊花中F3H基因及其啟動(dòng)子序列的信息較少。

本試驗(yàn)以作者團(tuán)隊(duì)自育的茶菊(Chrysanthemummorifolium)品種‘14-C-1’為試驗(yàn)材料，克隆并分析了CmF3H基團(tuán)及其啟動(dòng)子序列，利用熒光定量PCR分析了CmF3H基因在‘14-C-1’不同組織部位的表達(dá)水平，以期為深入研究CmF3H基因功能，提高茶菊黃酮類化合物含量，改良茶菊品質(zhì)提供一定分子基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)所用材料為北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心自育的茶菊(Chrysanthemummorifolium)品種‘14-C-1’，種植于25 ℃的玻璃溫室中。

1.2 方 法

1.2.1CmF3H基因的克隆取茶菊‘14-C-1’頂端葉片2～3片，利用RNA提取試劑盒(MiniBEST Plant RNA Extraction Kit, TaKaRa公司)，提取總RNA，再用PrimeScriptTMⅡ 1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)將所提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并檢測(cè)其濃度。根據(jù)F3H的保守序列，在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中通過Blast比對(duì)得到CmF3H基因相關(guān)的序列信息。利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)特異引物CmF3H-F/R (表1)，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃變性 10 s，55 ℃ 退火15 s；72 ℃ 延伸1 min；32個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳，切取特異片段，回收純化目的片段后連接到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)化、測(cè)序，獲得CmF3H的ORF全長(zhǎng)序列。

1.2.2CmF3H基因生物信息學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析利用NCBI Conserve Domain Database分析CmF3H蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，利用ExPaSy(https://web.expasy.org/protparam/)在線預(yù)測(cè)CmF3H蛋白的分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)及疏水性等理化性質(zhì)；下載其他物種F3H基因編碼氨基酸序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)；運(yùn)用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3CmF3H基因啟動(dòng)子的克隆和元件功能分析取茶菊‘14-C-1’葉片，采用CTAB方法提取DNA，采用染色體步移試劑盒(Genome Walking Kit，TaKaRa公司)克隆CmF3H啟動(dòng)子，根據(jù)CmF3H序列設(shè)計(jì)特異引物，SP1、SP2和SP3(表1)，三輪PCR模板依次為菊花基因組DNA、第一輪PCR產(chǎn)物和第二輪PCR產(chǎn)物，反應(yīng)體系：10×PCR 緩沖液2.5 μL；Mg2+1.5 μL；dNTP(2.5mmol/L) 4.0 μL；AP(50 μmol/L) 1.0 μL；SP(10 μmol/L) 1.0 μL；DNA 1.0 μL；LA Taq 0.25 μL；ddH2O補(bǔ)充到25 μL，反應(yīng)程序見試劑盒說明書。瓊脂糖凝膠電泳，切取特異片段，回收純化片段。將片段連接到pGEM-T Easy載體中，轉(zhuǎn)化、測(cè)序。采用數(shù)據(jù)庫(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)分析預(yù)測(cè)順式作用元件[13]。

表1 引物序列

1.2.4CmF3H基因在‘14-C-1’不同組織部位中的表達(dá)分析利用RNA提取試劑盒(MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，TaKaRa公司)提取茶菊‘14-C-1’不同組織部位根、莖、葉、花蕾、舌狀花和筒狀花的RNA，消除基因組DNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit，TaKaRa公司)將所提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并檢測(cè)其濃度。利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)CmF3H特異性引物，qCmF3H-F/R，以UBIQUITIN基因?yàn)閮?nèi)參[14](表1)，參照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq TM，TaKaRa公司)說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus，2×) 10 μL；cDNA 1.0 μL；qCmF3H-F 1.0 μL；qCmF3H-R 1.0 μL；ddH2O補(bǔ)充到20 μL，反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性30 s，95 ℃ 變性3 s，60 ℃ 復(fù)性30 s，40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增儀器為Applied Biosystems StepOnePlusTMReal-Time PCR儀，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[15]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊花CmF3H基因的克隆及其結(jié)構(gòu)域分析

以‘14-C-1’cDNA為模板，克隆得到約1 200 bp條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明CmF3H基因全長(zhǎng)1 284 bp，開放閱讀框1 095 bp，編碼364個(gè)氨基酸。Blast蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，‘14-C-1’CmF3H與菊花栽培種‘SU07’的氨基酸序列相似性最高，為99.16%。

M. DL2000；1. CmF3H圖1 茶菊‘14-C-1’CmF3H基因克隆電泳檢測(cè)Fig.1 Analysis of CmF3H gene from Chrysanthemum morifolium ‘14-C-1’

紅色方框表示2-O-酮戊二酸和Fe(Ⅱ)依賴性雙加氧酶結(jié)構(gòu)域；‘14-C-1’CmF3H. 茶菊‘14-C-1’；‘SU07’CmF3H. 菊花‘SU07’；RrF3H. 玫瑰；CsF3H. 茶樹；MaF3H. 桑樹；GhF3H. 棉花；PnF3H. 三七；CaF3H. 喜樹；VcF3H. 藍(lán)莓；CtF3H. 紅花；CcF3H. 矢車菊；DpF3H. 大麗花圖2 ‘14-C-1’CmF3H與其他物種同源蛋白F3H氨基酸序列比對(duì)Red frame. Functional region of 2-oxoglutarate (2OG) and Fe (Ⅱ) -dependent oxygenase；‘14-C-1’ CmF3H. Chrysanthemum morifolium ‘14-C-1’; ‘SU07’ CmF3H. Chrysanthemum morifolium ‘SU07’; RrF3H. Rosa rugosa; CsF3H. Camellia sinensis; MaF3H. Morus alba; GhF3H. Gossypium hirsutum; PnF3H. Panax notoginseng; CaF3H. Camptotheca acuminata; VcF3H. Vaccinium corymbosum; CtF3H. Carthamus tinctorius; CcF3H. Centaurea cyanus; DpF3H. Dahlia pinnataFig.2 Alignment of amino-acid sequences between ‘14-C-1’ CmF3H and F3H homologues from other species

與玫瑰、茶樹、桑樹、棉花、三七、喜樹、藍(lán)莓、紅花和大麗花等物種的F3H氨基酸序列相似性分別為81.88%、81.19%、79.46%、79.76%、83.39%、80.24%、83.75%、80.90%和82.97%。氨基酸序列多重比對(duì)(圖2)發(fā)現(xiàn)，CmF3H蛋白序列含有2-O-酮戊二酸和Fe2+-依賴的雙加氧酶家族的保守結(jié)構(gòu)域(從第200個(gè)氨基酸到第300個(gè)氨基酸)，推斷它在菊花黃酮類化合物合成過程中發(fā)揮著與其他物種F3H蛋白相同或相似的功能。

2.2 CmF3H基因生物信息學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析

蛋白序列結(jié)構(gòu)分析表明，CmF3H分子量為41.19 kD，等電點(diǎn)為5.57，不穩(wěn)定系數(shù)為39.51，平均親水性為-0.465，脂肪指數(shù)為83.02，表明該蛋白為穩(wěn)定、疏水性蛋白。用亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)與分析網(wǎng)站對(duì)CmF3H進(jìn)行定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，細(xì)胞質(zhì)60.9%，細(xì)胞核26.1%，線粒體4.3%，液泡4.3%，分泌系統(tǒng)的小泡4.3%。由此得出，CmF3H主要定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。

圖3 茶菊‘14-C-1’與其他物種F3H的進(jìn)化樹分析Fig.3 F3H phylogenetic tree analysis of C. morifolium ‘14-C-1’ and other species

M.DL2000；1、3、5、7. 二輪PCR產(chǎn)物，引物分別為AP1+SP2、AP2+SP2、AP3+SP2和AP4+SP2；2、4、6、8. 三輪PCR產(chǎn)物，引物分別為AP1+SP3、AP2+SP3、AP3+SP3和AP4+SP3圖4 茶菊‘14-C-1’CmF3H基因啟動(dòng)子克隆電泳檢測(cè)M. DL2000; 1, 3, 5, 7. The second round of PCR products, primer is AP1+SP2, AP2+SP2, AP3+SP2 and AP4+SP2; 2, 4, 6, 8. The third round of PCR products, primer is AP1+SP3, AP2+SP3, AP3+SP3 and AP4+SP3Fig.4 Analysis of CmF3H gene promotor from C. morifolium ‘14-C-1’

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖3)表明，茶菊‘14-C-1’與菊花栽培種‘SU07’親緣關(guān)系最近。其次為菊科植物大麗花、矢車菊，與玫瑰、三七、茶樹等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 CmF3H基因啟動(dòng)子序列的克隆與分析

克隆獲得‘14-C-1’CmF3HORF上游長(zhǎng)1 217 bp(圖4)。啟動(dòng)子序列分析(表2)顯示CmF3H基因啟動(dòng)子除包含真核生物核心啟動(dòng)子元件TATA-box、AT～TATA-box和CAAT-box外，還含有MYB識(shí)別位點(diǎn)MYBCORE、MYBCOREATCYCB1和MYB2CONSENSUSAT，以及調(diào)控功能元件：光響應(yīng)元件BOX4和IBOXCORE、光響應(yīng)與組織特異性表達(dá)元件G-box和GATA-box、ABA響應(yīng)元件MYB1AT、干旱和ABA響應(yīng)元件MYC、熱誘導(dǎo)元件CCAAT-box、種子發(fā)育調(diào)控元件ACGTC-box等，這些元件表明該啟動(dòng)子很可能受光、ABA、干旱等外界環(huán)境因素的調(diào)控。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖5 茶菊‘14-C-1’不同組織部位CmF3H基因相對(duì)表達(dá)量Different normal letters indicate significant difference at 0.05 level (P<0.05)Fig.5 Relative expression of CmF3H gene among different tissues of C. morifolium ‘14-C-1’

2.4 CmF3H基因在‘14-C-1’不同組織部位中的相對(duì)表達(dá)量

熒光定量PCR分析結(jié)果(圖5)顯示，CmF3H在‘14-C-1’筒狀花中表達(dá)量最高，其次為莖、花蕾、葉、舌狀花，在根中的表達(dá)量最低。其中筒狀花的表達(dá)量與根、莖、葉等組織部位的表達(dá)量均存在顯著性差異。

3 討 論

目前，人們對(duì)植物中次生代謝產(chǎn)物的研究主要集中在黃酮類化合物、萜類化合物和生物堿等物質(zhì)。其中黃酮類化合物是多種藥用植物有效成分之一。黃酮類化合物合成途徑的關(guān)鍵酶為F3H[16]。通過開展F3H基因及其啟動(dòng)子的克隆與功能分析，為提高植物中黃酮類化合物的含量提供理論支持，有助于藥食兩用植物的品質(zhì)改良。

本試驗(yàn)從茶菊品種‘14-C-1’中克隆得到黃酮類化合物合成相關(guān)基因CmF3H。氨基酸序列分析表明，CmF3H編碼氨基酸與其他物種F3H編碼氨基酸序列有較高相似性，且具有2-O-酮戊二酸和Fe2+-依賴的雙加氧酶家族的保守結(jié)構(gòu)域，屬于2-酮戊二酸依賴雙加氧酶蛋白家族。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，CmF3H蛋白序列與菊科植物如‘SU07’、大麗花、矢車菊、紅花等聚為一類，說明F3H基因序列在菊科中的保守性相對(duì)較高，在基因進(jìn)化方面不屬于活躍類型，在基因表達(dá)的過程中，一般不會(huì)出現(xiàn)個(gè)別堿基的缺失或突變，從而保證在植物黃酮類化合物合成過程中正常表達(dá)發(fā)揮作用。單拷貝基因能被更好的調(diào)節(jié)控制，F(xiàn)3H基因在大多數(shù)植物中以單拷貝形式存在，如玉米、矮牽牛、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、山葡萄(Vitisamurensis)等，但也存在多拷貝形式，如葡萄(Vitisvinifera)中有2個(gè)拷貝[17-18]，紫蘇(Perillafrutescens)中有2～3個(gè)拷貝[19]，小麥(Triticumaestivum)中存在4個(gè)拷貝[20]。

表2 茶菊‘14-C-1’CmF3H基因啟動(dòng)子元件分析

研究表明，F(xiàn)3H基因在植物不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量不同。Kumar等[21]對(duì)余甘子(Phyllanthusemblica)中F3H基因在不同組織部位及不同時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PeF3H基因在花朵中的表達(dá)量較葉片和果實(shí)高，在果實(shí)成熟的過程中該基因表達(dá)量逐漸升高。毛玉珊[22]對(duì)檸條(Caraganakorshinskii)F3H基因組織特異性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CkF3H基因在檸條根、莖、葉中均有不同量的表達(dá)。本試驗(yàn)通過qRT-PCR對(duì)茶菊‘14-C-1’不同組織部位CmF3H基因相對(duì)表達(dá)量表明，CmF3H基因在根、莖、葉、花蕾、舌狀花和筒狀花中均有不同量的表達(dá)，表明該基因在茶菊‘14-C-1’中存在組織特異性；在筒狀花中表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織部位的表達(dá)量，推測(cè)筒狀花中所積累的黃酮類化合物如花色素類、黃酮醇類、黃烷醇類等物質(zhì)高于其他組織部位，為以后茶用菊花育種和品質(zhì)改良提供參考。

F3H基因功能的研究表明，F(xiàn)3H基因的表達(dá)受UV-B、鹽、干旱、光照等多種因素的調(diào)控，在模式植物煙草中過表達(dá)F3H基因可提高轉(zhuǎn)基因植株中黃酮類化合物的含量及其抗逆能力。Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)在UV-B輻射和干旱脅迫下，沙漠植物紅砂(Reaumuriasoongorica)RsF3H酶活性增加，黃酮類化合物合成途徑中產(chǎn)物積累，qRT-PCR分析表明，RsF3H基因的表達(dá)迅速增加；Mahaja等[24]研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下茶和轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotianatabacum)中F3H基因的表達(dá)量及酶活性都顯著上升，黃烷-3-醇含量增加，對(duì)鹽脅迫的耐受性明顯增強(qiáng)；Song等[25]克隆枸杞(Lyciumchinense)的F3H基因并在煙草中過表達(dá)，試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草植株黃烷-3-醇的含量升高，抗氧化能力增強(qiáng)，對(duì)干旱脅迫的抵抗力增強(qiáng)。此外，F(xiàn)3H基因還能夠在植物受到生物脅迫時(shí)發(fā)揮作用，Gutiérrez-Albanchez等[26]用芽孢桿菌QV15誘導(dǎo)黑莓(Rubuscv. Loch Ness)，試驗(yàn)結(jié)果表明RuF3H基因可改善植物在受到生物脅迫的適應(yīng)性，提高果實(shí)品質(zhì)。

不同的環(huán)境因素影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，植物可以通過啟動(dòng)子中的順式元件與轉(zhuǎn)錄因子相互協(xié)調(diào)，對(duì)脅迫產(chǎn)生應(yīng)答。本研究中，CmF3H基因啟動(dòng)子序列存在多個(gè)與光照、溫度、UV-B、ABA等相關(guān)的元件，以及MYB識(shí)別位點(diǎn)等。MYB轉(zhuǎn)錄因子普遍存在于植物中，廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝調(diào)控，在非生物脅迫(如干旱、低溫、高鹽以及紫外輻射等)條件下，該轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)會(huì)發(fā)生特異性變化，增強(qiáng)植物適應(yīng)復(fù)雜多變環(huán)境的能力。有研究表明MYB識(shí)別位點(diǎn)MYBCORE能調(diào)控牽牛花花瓣上表皮黃酮類化合物的生物合成[27]。茶菊品種‘14-C-1’CmF3H基因是否能夠響應(yīng)不同脅迫及ABA處理，進(jìn)而影響黃酮類化合物成分的合成，還需進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)成功從茶菊‘14-C-1’中克隆了CmF3H基因及其啟動(dòng)子，在后續(xù)的研究中將通過構(gòu)建過表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)，并分析轉(zhuǎn)基因植株中黃酮類化合物成分和含量，探究CmF3H的生物學(xué)功能。為后續(xù)茶菊分子育種提供有效基因元件，為獲得高含量黃酮的茶菊品種奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。