青稞HvtAGO1基因的克隆及其在條紋病脅迫下的表達(dá)

姚曉華，王 越，安立昆，姚有華，楊 雪，白羿雄，吳昆侖*

(1 青海大學(xué), 西寧 810016；2 青海省農(nóng)林科學(xué)院, 西寧 810016；3 青海省青稞遺傳育種重點實驗室/國家麥類改良中心青海青稞分中心, 西寧 810016)

青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHook. f.)為禾本科大麥屬，是栽培大麥的一個變種，因其成熟時籽粒內(nèi)外稃與穎果分離，籽粒裸露，故又稱裸大麥[1]。公元5世紀(jì)以來，青稞是藏族同胞的主糧，在青藏高原被廣泛種植，為藏區(qū)的糧食安全提供了重要保障[2-3]。青稞籽粒含有豐富的營養(yǎng)成分和生理活性物質(zhì)，因此具有豐富的營養(yǎng)價值和醫(yī)藥保健作用[4-5]。

條紋病是青稞生產(chǎn)中一種常見的種傳病害，主要由麥類核腔菌[Pyrenophoragraminea(Rabenh.) Ito et Kurib.]引起，屬于真菌性病害[6]。條紋病害一旦發(fā)生會使大麥產(chǎn)量大幅度降低，易感品種產(chǎn)量可降低92%[7]；2012年青海省青稞條紋病發(fā)生面積5.2×104hm2，占播種面積的60%，發(fā)病率在15%～20%，重者達(dá)50%，條紋病嚴(yán)重影響著青稞的產(chǎn)量與品質(zhì)[8]。目前條紋病的主要防治方法是種子包衣[9]，但青藏高原地區(qū)生態(tài)環(huán)境脆弱，嚴(yán)控農(nóng)藥化肥，種子包衣防治難以推行，因此抗病品種的選育是防控條紋病最有效、最環(huán)保的方式。大麥條紋病抗性是一個復(fù)雜的性狀，涉及許多抗病基因[10]。數(shù)量性狀位點(QTL)分析是大麥抗病育種中獲得關(guān)鍵性狀基因的有效方法[11-12]。例如，將QTL分析應(yīng)用于抗條紋病和易感大麥品種雜交后代，鑒定出Rdg1a和Rdg2a兩個抗病基因，分別位于2HL和7HS染色體上[12-15]，其過表達(dá)顯著增強了大麥對條紋病的抗性[16-19]。然而，通過QTL分析，只發(fā)現(xiàn)了少數(shù)抗條紋病基因。說明通過傳統(tǒng)的基因定位獲得抗條紋病基因可能遇到了瓶頸，因此需要新的方法和視角來探索與條紋病抗性相關(guān)的植物新基因。

Argonaute(AGO)蛋白是核糖核酸介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控復(fù)合物的重要蛋白，最初在擬南芥中發(fā)現(xiàn)[20]。該蛋白主要由可變N端、PAZ(PIWI-Argonaute-Zwille)、PIWI(Pelement-induced wimpy testis)和MID(Middle)4個結(jié)構(gòu)域組成，有的還有DUF1785(Domains of unknown function protein 1785)和AgoL2(Argonaute linker 2)兩個結(jié)構(gòu)域，其中PAZ 結(jié)構(gòu)域和C末端的PIWI 結(jié)構(gòu)域為2個標(biāo)志性的功能域[21-22]。研究表明，AGO蛋白可以與不同類型的小RNA結(jié)合，在植物的抗病中發(fā)揮重要作用。番茄miR403可以通過靶向AGO2基因調(diào)控葉縮短病[23]；在水稻中，病毒誘導(dǎo)的OsAGO18能夠抑制miR168，從而減輕miR168對水稻OsAGO1的抑制，使感染RSV病毒(Ring Sopt Virus)的水稻具有抗病毒防御能力[24]；在煙草中，AGO1的差異表達(dá)能夠改變植物對病毒感染的耐受能力，使遭受病毒侵染的煙草不僅恢復(fù)性狀，同時還增強了冷脅迫的耐受能力[25]。

本研究通過分析不同抗性青稞品種條紋病感染后的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，鑒定出一個差異表達(dá)的AGO基因，在Swiss-Prot中被注釋為AGO1基因。在抗病品種‘昆侖14號’和感病品種‘Z1141’中克隆了該基因，分析了其序列的結(jié)構(gòu)、生理生化特性以及與其他禾本科植物的進(jìn)化關(guān)系，利用psRNATarget在線工具預(yù)測了調(diào)控該基因的miRNA(hvu-miR168-5p)，并利用降解組測序驗證了兩者的靶向關(guān)系。利用實時熒光定量PCR分析了HvtAGO1基因和調(diào)控其表達(dá)的hvu-miR168-5p在青稞條紋病脅迫下的響應(yīng)模式，以期為進(jìn)一步研究HvtAGO1基因的抗條紋病功能和抗病機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

抗病青稞品種‘昆侖14號’和感病青稞品種‘Z1141’由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院作物栽培與育種研究所青稞研究室提供?！?4號’條紋病發(fā)病率<10%，‘Z1141’條紋病發(fā)病率>90%。

1.2 方 法

1.2.1 青稞葉片總RNA的提取及cDNA合成利用植物總RNA提取試劑盒(天根)提取青稞品種‘昆侖14號’和‘Z1141’的總RNA，用超微量核酸蛋白測量儀(NanoPhotometer)測定RNA的濃度和純度，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。參照第一鏈cDNA合成試劑盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)合成cDNA，-80 ℃保存。

1.2.2 青稞HvtAGO1基因的克隆從‘昆侖14號’和 ‘Z1141’ 青稞品種條紋病感染前后差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)結(jié)果中獲得1個差異表達(dá)的AGO基因(Gene IDHORVU7Hr1G007000)，利用Primer5.0設(shè)計該基因引物(表1)。以青稞‘昆侖14號’和‘Z1141’葉片cDNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(東洋紡試劑盒)。擴(kuò)增體系為25 μL，其中2×PCR Buffer for KOD Fx緩沖液12.5 μL、上下游引物各0.5 μL(10 μmol·L-1)、dNTPs 5 μL(2 mmol·L-1)、KOD酶0.5 μL(1.0 U·μL-1)、cDNA模板1 μL、ddH2O補足至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 2 min；98 ℃變性 10 s，56 ℃退火 30 s，68 ℃延伸40 min 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃ 保持5 min。乙醇沉淀法回收目的條帶，用超微量核酸蛋白測量儀測定回收產(chǎn)物的濃度和純度，再將其連接到pEasy-Blunt載體(全式金生物)上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞。挑取5個白斑單菌落進(jìn)行陽性克隆鑒定，至少3個陽性克隆送至上海生物工程股份有限公司，使用通用引物M13測序。

1.2.3 青稞HvtAGO1基因生物信息學(xué)分析利用Expasy Protparma(http://www.expasy.org/tools/protp aram.html)和Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和親/疏水性。利用SignalP4.1(http://www. Detaibio.com/tools/signal-peptide.html)和TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。利用CELLO 2.5 (http://cello.life.nctu.edu.tw)對HvtAGO1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測結(jié)構(gòu)域。利用SPOMA(https:// npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測HvtAGO1蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。利用SignalP 4.1(http：//www.detaibio. com/tools/signal-peptide. html)和TMHMM-2.0(http：//www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。利用NCBI中的Blastp功能，查詢與HvtAGO1蛋白同源的禾本科其他物種AGO1蛋白序列，用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行多序列比對，用Mega5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 調(diào)控HvtAGO1基因的miRNA鑒定利用psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/analysis?function=1)預(yù)測調(diào)控HvtAGO1基因的miRNA。利用降解組測序驗證miRNA與HvtAGO1基因的靶向關(guān)系。

表1 引物序列

1.2.5HvtAGO1基因及其調(diào)控miRNA在青稞條紋病脅迫下的表達(dá)分析采用Primer5.0設(shè)計hvu-miR168-5p和HvtAGO1的qRT-PCR引物，利用實驗室建立的青稞條紋病侵染體系，獲得條紋病侵染20 d后‘昆侖14號’和‘Z1141’正常葉片和感病葉片[26]。提取葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄后以cDNA(200 ng·μL-1)為模板，分別以5SrRNA和TC139057為內(nèi)參進(jìn)行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析，引物序列見表1。反應(yīng)體系為20 μL，其中TB Green premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，cDNA模板2 μL、(10 μmol·L-1)各0.8 μL和ddH2O 6.4 μL。qRT-PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性5 s， 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次；溶解曲線，95℃ 5 s，70 ℃ 1 min。應(yīng)用2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量[27]。每個樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞HvtAGO1基因的克隆與序列分析

以‘昆侖14號’和‘Z1141’的葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，HvtAGO1-F/R為引物，擴(kuò)增到一條約3 675 bp的目的條帶(圖1)。其完整開放閱讀框為3 651 bp，編碼1 217個氨基酸(GenBank 登錄號 MW387021)。測序后比對，‘昆侖14號’和‘Z1141’的堿基序列及其編碼的氨基酸序列相似性均為100%。利用SMART對其氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該基因具有典型的 PIWI、PAZ和DUF1785結(jié)構(gòu)域，同時具有Gly-rich-ArgoN(Glycine-rich region of argonaut)、ArgoN(N-terminal domain of argonaute)、ArgoL2 (Argonaute Linker 2)和ArgoMid(Mid domain of argonaute)結(jié)構(gòu)域，屬于AGOs 基因家族(圖2)。

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析表明，HvtAGO1蛋白分子式為C5861H9195N1785O1746S37，分子量為133.79 kD，不穩(wěn)定指數(shù)為50.90，脂溶指數(shù)是65.90，理論等電點為9.49，其中負(fù)電荷殘基(Asp + Glu) 為112個，正電荷殘基(Arg + Lys)為149個。平均疏水性(GRAVY)為-0.694。預(yù)測結(jié)果表明，HvtAGO1蛋白是一個親水性的不穩(wěn)定堿性蛋白。對HvtAGO1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)與信號肽預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，且無信號肽。CELLO V.2.5分析表明，HvtAGO1蛋白可能定位在細(xì)胞周質(zhì)中，得分為1.492。該蛋白定位到細(xì)胞結(jié)構(gòu)的可能性：細(xì)胞周質(zhì)(1.492)>細(xì)胞外(1.165)>外膜(0.818)> 細(xì)胞質(zhì)(0.802)>內(nèi)膜(0.722)。

圖2 HvtAGO1基因結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.2 Domain prediction of HvtAGO1 gene

藍(lán)色表示α-螺旋；紅色表示延伸鏈；綠色表示β-轉(zhuǎn)角；橙色表示無規(guī)則卷曲; 紫色表示HvtAGO1蛋白氨基酸長度圖3 HvtAGO1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Blue stands for α-helix; Red stands for extended chain; Green stands for β- turn; Orange stands for randon coil; Purple stands for the amino acid length of HVTAGO1 proteinFig.3 Secondary structure prediction of HvtAGO1

對HvtAGO1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明：HvtAGO1蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要是由無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角組成，其中無規(guī)則卷曲占56.41%，α-螺旋占25.74%，延伸鏈占13.40%，β-轉(zhuǎn)角占4.44%(圖3)，可見該基因是以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，這2個二級結(jié)構(gòu)在蛋白行使功能時可能發(fā)揮重要作用。用SWISS-MODEL對HvtAGO1蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，由圖4可知，HvtAGO1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域折疊成錘子狀，主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成，錘身包含了PIWI特征結(jié)構(gòu)域；錘柄主要包含PAZ特征結(jié)構(gòu)域。Unipro基因注釋結(jié)果表明該蛋白為AGO1，因此將該基因命名為HvtAGO1。

圖4 HvtAGO1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Tertiary structure prediction of HvtAGO1

Hvt. 青稞；Hv. 大麥；Bd. 二穗短柄草；Si. 粟；At. 山羊草； Tu. 烏拉爾圖小麥；Zm.玉米；黑線表示DUF1785結(jié)構(gòu)域；紅線表示PAZ結(jié)構(gòu)域；綠線表示PIWI結(jié)構(gòu)域圖5 HvtAGO1與其他禾本科植物蛋白和DUF1785、PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域序列比對Hvt. Hordeum vulgare(Tibetan hulless barley)；Hv. Hordeum vulgare；Bd. Brachypodium distachyon；Si. Setaria italica；At. Aegilops tauschii；Tu.Triticum urartu；Zm. Zea mays；The bold black frame represents NB-ARC conserved functional region of N/A protein；The black line represents DUF1785 conserved domain; The red line represents PAZ conserved domain; The green line represents PIWI conserved domainFig.5 Multiple alignment of HvtAGO1 and three domains (DUF1785, PAZ and PIWI) compared with other Gramineae plants

2.2 HvtAGO1蛋白的同源比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖5顯示，青稞HvtAGO1蛋白與山羊草(Aegilopstauschii)、二穗短柄草 (Brachypodiumdistachyon)和烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)等的AGO1蛋白序列相似性分別為96.64%、79.34%和80.07%，這些序列都具有高度保守的DUF1785、PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，在7種禾本科植物種中，青稞HvtAGO1蛋白與山羊草的親緣關(guān)系最近，與玉米和粟的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖6)。

圖6 HvtAGO1蛋白與禾本科其他植物系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree analysis of the HvtAGO1 protein and other Gramineae plants

A. hvu-miR168-5p剪切靶基因HvtAGO1的位置；B.hvu-miR168-5p剪切靶基因HvtAGO1的靶點鑒定；在A中HvtAGO1下方箭頭和B中圓點表示hvu-miR168-5p指向的裂解位點圖7 hvu-miR168-5p剪切靶基因HvtAGO1的位置和靶點鑒定1.Position of hvu-miR168-5p shearing target gene HvtAGO1; B. Target identification of hvu-miR168-5p shearing target gene HvtAGO1; The arrow below HvtAGO1 in A and the dot in B indicated hvu-miR168-5p-directed cleavage siteFig.7 Position and target identification of hvu-miR168-5p shearing target gene HvtAGO1

2.3 調(diào)控HvtAGO1基因的miRNA的鑒定

利用在線工具預(yù)測調(diào)控HvtAGO1基因的miRNA為hvu-miR168-5p；同時降解組測序結(jié)果證明，HvtAGO1確實為hvu-miR168-5p的靶基因，其剪切位置為HvtAGO1基因的832 bp處(圖7)。由此說明hvu-miR168-5p和靶基因HvtAGO1存在靶向作用關(guān)系。

2.4 hvu-miR168-5p和靶基因HvtAGO1在條紋病脅迫下的表達(dá)

利用實時定量PCR檢測了HvtAGO1和調(diào)控其表達(dá)的hvu-miR168-5p在條紋病脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果(圖8)表明，抗病青稞品種‘昆侖14號’和感病青稞品種‘Z1141’在條紋病菌感染后，hvu-miR168-5p和其靶基因HvtAGO1表達(dá)量均極顯著上調(diào)(P<0.01)。其中，病菌侵染后hvu-miR168-5p在‘昆侖14號’葉片表達(dá)量為未侵染的42.24倍，而‘Z1141’為未侵染的7.21倍；病菌侵染后HvtAGO1在‘昆侖14號’葉片的表達(dá)量為未侵染的14.37倍，‘Z1141’為未侵染的5.08倍。且病菌侵染后，hvu-miR168-5p和靶基因HvtAGO1在‘昆侖14號’葉片的表達(dá)量均極顯著高于‘Z1141’(P<0.01)。推測hvu-miR168-5p和靶基因HvtAGO1在青稞抗條紋病過程中發(fā)揮重要作用。

N.正常葉片；S.感病葉片；**表示同一品種同一基因的感病葉片與正常葉片差異極顯著 (P <0.01)圖8 不同抗性青稞品種hvu-miR168-5p和靶基因HvtAGO1在條紋病脅迫下的表達(dá)N. Normal leaves; S. Leaves with barley leaf stripe; ** stands for significant difference between leaves with barley leaf stripe and normal leaves within same variety and gene at 0.01 levelFig.8 Expression levels of hvu-miR168-5p and target gene HvtAGO1 in different resistant Tibetan hulless barley infection with barley leaf stripe

3 討 論

近年來，AGOs家族基因已經(jīng)從擬南芥、蘋果、玉米、水稻等多種高等植物中被分離鑒定出來[28-31]。RNA干擾在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用，在水稻和玉米中已經(jīng)證實，AGO蛋白是已知的小RNA調(diào)控通路的核心部分，通過抑制靶基因的表達(dá)來調(diào)控發(fā)育過程[30-31]。然而，青稞HvtAGOs相關(guān)基因序列和抗病功能目前還沒有相關(guān)研究。本研究從青稞抗病品種‘昆侖14號’和 感病品種‘Z1141’條紋病感染前后轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的基因注釋中獲得的一個HvtAGO1基因，進(jìn)一步對其進(jìn)行了克隆和序列分析。已有研究表明，AGO1 參與的通路包括miRNA 通路、轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)通路、病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)或抗病毒沉默通路和ta-siRNA 通路[28]。AGO1主要結(jié)合miRNA在細(xì)胞質(zhì)中通過切割靶mRNA或介導(dǎo)翻譯抑制在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因表達(dá)[32]。在擬南芥中，AtAGO1 能與病毒siRNA結(jié)合形成RNA沉默復(fù)合體，在抗病中發(fā)揮重要作用[33]。因此推測，HvtAGO1編碼的蛋白在青稞中的作用與同類AGO1蛋白在其他植物中的作用相似。

前人研究表明，AGO蛋白包含高度保守的結(jié)構(gòu)域，如DUF1785、PAZ和PIWI，這些結(jié)構(gòu)域在結(jié)合sRNA雙鏈和裂解靶RNA中起重要作用[34-36]。本研究從青稞分離的與條紋病相關(guān)的HvtAGO1蛋白與山羊草、二穗短柄草、小麥等6個禾本科植物的AGO1蛋白序列相似性為87.05%，其中DUF1875、PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域相似性分別為97.57%，98.44%和96.02%。可見，7個AGO1蛋白雖然相似性不太高，但3個結(jié)構(gòu)域相似性均大于95%，結(jié)構(gòu)域的較高保守性也說明了他們在特異地與小RNA 結(jié)合進(jìn)行目標(biāo)靶基因切割時，可能存在基因功能的一致性[37]。另外發(fā)現(xiàn)，青稞與大麥的AGO1蛋白序列相似性僅為82.69%，青稞與大麥相比，在70～137 bp和185～234 bp產(chǎn)生片段插入，這2個片段的插入導(dǎo)致兩者在進(jìn)化上產(chǎn)生距離，是否會導(dǎo)致功能差異，還有待進(jìn)一步研究。

2010年Kantar等[38]首次從大麥中分離出miR168，之后又有學(xué)者從干旱、鎘、鋁和鹽脅迫下的水稻[39]和黃瓜[40]中分離出miR168。利用轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行的啟動子分析顯示，真菌可以激活miR168，而且能夠上調(diào)控制葉片形態(tài)和植物生長[41]。在番茄卷曲葉病毒感染期間也發(fā)揮抗病作用[24]。本研究中，青稞條紋病感染前后的降解組測序結(jié)果中，HvtAGO1被miR168-5p剪切。研究表明，miR168能夠調(diào)控AGO1基因的表達(dá)，AGO1作為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA induced silencing complex, RISC)中轉(zhuǎn)錄調(diào)控或/和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的核心元件，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，參與植物發(fā)育過程和病毒防御[41]。本研究在證明了HvtAGO1為hvu-miR168-5p的靶基因后，利用qRT-PCR表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，青稞葉片被條紋病菌侵染后hvu-miR168-5p被激活，且抗病品種表達(dá)量顯著高于感病品種，推測該miRNA在青稞抗條紋病過程中發(fā)揮重要作用，能夠正向調(diào)控條紋病抗性。同時，靶基因HvtAGO1在受青稞條紋病侵染后，葉片中的表達(dá)與hvu-miR168-5p呈相同的表達(dá)趨勢，這與被RMV、CMV和TCV感染的擬南芥中miR168和AtAGO1的表達(dá)量總是與病毒感染過程的進(jìn)展同時增加的結(jié)果類似[42]。HvtAGO1和hvu-miR168-5p表達(dá)水平的同時升高可能是兩者均具有協(xié)同表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制[43]。但兩者在青稞抗條紋病過程中的具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。