結腸腺瘤患者與健康人腸液菌群的結構差異性分析

張蓓,陳文暉,汪妍

結腸腺瘤(colorectal adenomatous polyps, CAP)是起源于結直腸黏膜腺上皮的良性腫瘤，是常見的腸道良性腫瘤，被認為是最主要的癌前病變[1]。不同地區(qū)、不同年齡的發(fā)病率差別很大，40歲以下的發(fā)病率低，60歲以上較高，男女無明顯差別。病因及發(fā)病機制尚不明確。腸道菌群是一個多樣化的微生態(tài)系統，它是由超過2 000種細菌種類組成，并且擁有比人類基因組多出150倍的特殊基因組[2-3]。腸道微生物群可經內分泌、免疫、神經等途徑來對宿主的消化吸收、能量代謝及免疫防御等基本功能產生影響[4,-5]。實踐示，腸道菌群的穩(wěn)態(tài)失調，對脂肪肝患者[6]、糖尿病患者[7]、炎癥性腸病[8-9]患者[8、9]等患者等都有重要影響；現有研究認為腸道菌群和結腸腺瘤、結腸癌的發(fā)病也密切相關[10-12]，但腸道菌群在結腸腺瘤、結腸癌中具體作用機制仍未明確，本實驗研究從菌群的動態(tài)變化展開分析，探討腸道菌群在結直腸腺瘤發(fā)生發(fā)展中的適應性改變，從而深入了解腸道菌群在結直腸腺瘤發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般材料

本研究經過上海電力醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，選取2019年1月至9月上海電力醫(yī)院消化內科結腸腺瘤患者10例(腺瘤組)和腸鏡檢查無異常的健康人12例(對照組)，取其腸液樣本。入組標準為：①年齡30～60周歲；②無肥胖以及超重的情況；③無胃腸手術史；④無遺傳性非息肉性大腸癌及家族性腺瘤性息肉?。虎轃o感染性疾病、慢性病、代謝性疾病；⑥腸鏡檢查前3個月內未用過抗生素、激素、益生菌；⑦無特殊飲食習慣；⑧納入對象知情同意。選取單發(fā)的結腸腺瘤患者，部位分布：升結腸1例、橫結腸2例、降結腸2例、乙狀結腸3例、直腸2例，腺瘤直徑在3～0.8 cm，結腸腺瘤患者均經組織病理明確為腺瘤性息肉。健康組取標本部位：升結腸2例、橫結腸2例、降結腸2例、乙狀結腸3例、直腸3例，均腸鏡檢查提示未見異常。標本采集：檢查當日完善腸道清潔準備，晨5～6時口服復方聚乙二醇電解質2袋(沖泡2 000 mL液體)，確定腸道準備完成后行無痛結腸鏡檢查，吸取腸液放入滅菌消毒后的EP管中，-40 ℃冰箱冷藏待檢。

1.2 方法

對獲取的腸液細菌16SrRNA基因序列V3-V4高變區(qū)片段進行精準的PCR擴增，PCR擴增應用的為NEB公司生產的Q5高保真DNA聚合酶，并對擴增循環(huán)數嚴格控制，使循環(huán)數盡可能低的同時，也確保同批樣本擴增條件一致，擴增后對PCR產物定量檢測，完成純化后的混合DNA產物在lluminaMiSeq平臺上完成高通量測序分析。為對原始雙端測序數據進行整合，首先應用滑動窗口法，依次對FASTQ格式所對應的雙端序列展開質量方面的篩查：窗口大小為10 bp，步長為1 bp，從5′第一個堿基處完成移動操作，要求窗口中堿基平均質量需≥Q20，自首個平均質量低于Q20的窗口處截斷序列，要求截斷后的序列長度需≥150 bp，另外，不允許存在模糊堿基N的情況。之后，利用FLASH軟件，對通過質量初篩的雙端序列根據重疊堿基進行配對連接：要求Read 1和Read 2序列重疊堿基長度需≥10 bp，并且堿基錯配數小于重疊堿基長度10%。最后，依據單個樣本所對應Index信息，將連接后的序列識別向對應樣本分配(要求Index序列完全匹配)，進而獲得每個樣本的有效序列(數據由派森諾生物有限公司提供)。

1.3 實驗流程

微生物組總DNA提取→目標片段PCR擴增→擴增產物進行回收純化→擴增產物實施熒光定量操作→測序文庫制備→上機進行高通量測序。

1.4 統計學方法

將OTU的代表序列與Greengenes數據庫(Release 13.8)相比對，使用QIIME軟件，調用UCLUST這一序列比對工具(Edgar, 2010)，按97%的序列相似度進行歸并和OTU劃分。然后，根據每個OTU在每個樣本中所包含的序列數，構建OTU在各樣本中豐度的矩陣文件(即OTU table)。計算物種累積曲線(Species accumulation curves)判斷樣本量是否足夠并估計群落豐富度(Chao and Shen, 2004)，當曲線趨于平緩時表明樣本量已足以反映群落的豐富度，反之則表明樣本量不足。使用豐度等級曲線(Rank abundance curve)了解群落物種的豐富度及均勻度，來反映樣本的多樣性。使用R語言工具繪制Specaccum物種累積曲線及豐度等級曲線。使用Metastats的統計學算法，在門和屬水平對兩組樣本組間差異進行兩兩比較檢驗，找到兩組之間的差異物種，使用錯誤發(fā)現率(False discovery rate，FDR)對P值進行校正，P值<0.05差異有統計學意義。將線性判別分析與非參數的Kruskal-Wallis以及Wilcoxon秩和檢驗相結合進行LEfSe(Linear discriminant analysis(LDA) coupled with effect size)分析，通過Galaxy在線分析平臺(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)，提交屬水平的相對豐度矩陣進行LEfSe分析。根據LDA差異分析對數得分值(>2)和P(<0.05)值描述在組間具有顯著差異的分類單元的統計學效力強弱。

2 結果

2.1 樣本物種豐富度分析

Specaccum物種累積曲線(圖1)示，物種累積曲線自樣本量超過10以后逐漸趨于平緩，樣本量達到15以后曲線已基本趨平，提示本次實驗樣本量已足以反映群落的豐富度。

圖1 Specaccum物種累積曲線圖 橫坐標為實驗樣本量，縱坐標為被檢測物種數，藍色陰影為曲線置信區(qū)間

樣本豐度等級曲線(圖2)從橫坐標看各樣本繪制成的曲線在橫軸上的跨度在300～1 000，跨度大，提示樣本的群落的豐富度高，縱坐標觀察曲線的下降趨勢，圖中各樣本代表曲線在OTU值(經Log2對數轉換)0～10表現為平緩下降，提示群落物種組成的均勻度較高。提示此次實驗中樣本群落多樣性高。

2.2 兩組腸液菌群門水平比較

所有樣本在優(yōu)勢菌門方面均包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，見圖3。對照組豐度最高的前3個門依次是：厚壁菌門(46.5%)、擬桿菌門(32.38%)、變形菌門(17.31%)；腺瘤組豐度最高的前3個門依次為：厚壁菌門(36.29%)、變形菌門(33.98%)、擬桿菌門(26.43%)，厚壁菌門/擬桿菌門比值呈下降征象。Metastat分析顯示，兩組間厚壁菌門、變形菌門豐度比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖3 兩組樣本在腸液菌群門水平上的相對豐度分布圖(X腺瘤組，Z對照組)

2.3 兩組樣本腸液菌群在屬水平上分析比較

兩組樣本腸液菌群屬水平相對豐度見圖4。Metastat分析顯示，兩組腸液菌群屬水平上有13組菌序列量(絕對豐度)存在顯著差異，豐度最高的菌屬分別有假單胞菌屬、擬桿菌屬、桿菌屬、腸球菌屬、螺桿菌屬等(圖5)。LEfSe統計檢驗結果(表1)，提示對照組中兩組樣本之間腸液菌群在屬水平上假單胞菌屬、桿菌屬、腸球菌屬存在顯著差異(P<0.05)。其中對照組的腸液菌群中Erysipelotrichaceae在兩組間有顯著差異(P=0.048)，屬于腸球菌屬，腺瘤組腸液菌群中Pyramidobacte、Dethiosulfovibrionaceae(P=0.007)、Pseudomonadaceae(P=0.013)、Gardnerella、Comamonas(P=0.048)等在兩組間有顯著差異，在細菌菌屬上屬于桿菌屬、假單胞菌屬。通過LDA值分布柱狀圖(圖6)，展示了LDA score大于預設值(2)、不同組中在豐度上有顯著差異的物種，長度越長表明該有顯著差異的物種影響越大，其中comamonas(假單胞菌)LDA差異分析對數得分值為4.286，為腺瘤組中有著顯著差異的物種中影響最大的，而對照組中Erysipelotrichaceae是對照組中影響最大的顯著差異的物種。

圖6 LDA值分布圖 綠色X腺瘤組，紅色Z對照組；縱坐標為組間差異顯著的分類單元，橫坐標為LDA差異分析對數得分值

表1 LEfSe統計檢驗結果(僅組間差異顯著者)

注：對數轉換值為各分類單元具有的最高組內相對豐度均值，組別為具有統計學差異的分類單元

圖5 兩組腸液菌群屬水平序列量比較 橫坐標為差異顯著的分類單元，縱坐標為各分類單元序列量。采用小提琴圖結合箱線圖的形式來呈現，“小提琴”的“胖瘦”可反映樣本數據分布的密度高低情況；箱線圖邊框代表上下四分位數間距，橫線代表中位值，上下觸須依次代表位于上下四分位外的1.5倍IQR范圍，符號“?”代表超過范圍的極端值

圖4 兩組樣本在屬水平相對豐度分布圖

2.4 菌群比較PLS-DA分析

PLS-DA判別圖(圖7)提示同一分組樣本點距離靠近，不同分組樣本點距離遠離，提示分類模型性能優(yōu)良。

圖7 PLS-DA判別分析圖 單個點對一個樣本，以橢圓標出相同分組的點；Z：對照組，X：腺瘤組

3 討論

本研究顯示，無論是對照組還是腺瘤組的腸液菌群檢測分析結果中，厚壁菌門(Firmicutes)均表現為占主體地位。所有樣本的優(yōu)勢菌門均包括厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)。腺瘤組變形菌門的豐度顯著升高(P<0.05)，腺瘤組優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬、桿菌屬，對照組優(yōu)勢菌屬為腸球菌屬。兩組樣本間腸液菌群結構組成在門、屬水平上存在明顯不同。腸道菌群定植腸道，構成腸道微生態(tài)平衡，對機體健康有重要的維護作用[13]。Baxter等[14]收集正常人及結腸腫瘤患者糞菌作研究材料，向無菌小鼠進行移植，并誘導腸癌模型，實驗結果表明，腫瘤的數目與基線菌群間關聯密切，即菌群的結構在一定程度上可決定腫瘤形成的易感性。Shen等[15]報道指出，臨床腺瘤性息肉患者，腸道菌群中擬桿菌比例下降，而變形菌比例經觀察呈升高狀態(tài)。Goedert等[13]報道指出，腺瘤患者與健康人比較，在糞便菌群方面差異明顯。

就門的水平展開分析，腺瘤組厚壁菌門較對照組占比明顯下降，同時厚壁菌/擬桿菌門比值也表現為下降，而變形菌門占比則升高。變形菌門屬于腸道菌群中較大的菌門，其中

γ-變形菌綱存在許多重要的已知病原菌及條件致病菌，其中部分條件致病菌如假單胞菌、部分桿菌，可釋放對人體有害的內毒素[16]，在腺瘤患者樣本中表現為明顯增加的情況。

腺瘤組中升高的假單胞菌屬，其中部分菌種對人和動物存在致病性，相關研究表明，結腸癌患者在手術完成后，腸道中分布的假單胞菌含量明顯增加[17-18]，表明假單胞菌屬與結腸癌發(fā)病可能存在相關性。雖然結腸腺瘤及結腸腫瘤發(fā)病機制是多方面的，并非單由菌群活動誘發(fā)，但菌群穩(wěn)態(tài)失調可能在結腸腺瘤、結腸腫瘤病程中起到了重要作用，通過早期對腸道菌群實施高通量測序，根據腸鏡菌群構成改變，可為早期篩檢、診治結腸癌前病變(結腸腺瘤)提供參考依據[19-20]。

綜上，結腸腺瘤患者腸液菌群結構呈明顯改變，形成了易于腺瘤生長的腸道微生態(tài)環(huán)境。通過優(yōu)化菌群結構可能可以干預結腸腺瘤及其他結腸癌前病變的發(fā)生，對預防結腸癌發(fā)生發(fā)展有重要的臨床意義。