超高效液相色譜-串聯(lián)質譜方法測定谷氨酰胺膠囊中谷氨酰胺含量

匡宇明 張繼榮 賀秀玲

黑龍江省傳染病防治院藥劑科，黑龍江哈爾濱 150500

液相色譜-質譜聯(lián)用技術在藥學、臨床醫(yī)學、生物學、化工等許多領域的應用越來越廣泛，可以對體內(nèi)藥物及代謝產(chǎn)物、藥物合成中間體、基因工程產(chǎn)品等進行定性鑒定和定量測定，解決單純用液相色譜或質譜不能解決的許多問題。超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）理論認為提高色譜柱的效能就能增加儀器的解析度，而運用粒徑低于2 μm 的小顆粒無疑是增加效能的好方法。但減小固定相的粒度以增加色譜柱效能一直是色譜儀器科學的瓶頸，因為小顆粒不僅要求系統(tǒng)能承受高于目前極限壓力，需要更小的系統(tǒng)體積，并且需要能適應可能只有幾秒峰寬的高速檢測器[1-6]。與傳統(tǒng)的高效液相色譜相比，UPLC 具有以下優(yōu)勢：高分離度，高速度，靈敏度。過去對于提高靈敏度的研究大都集中于檢測器上，不論是光學檢測器還是質量檢測器。但是，其實運用UPLC 也能提高分析的靈敏度。目前，UPLC 多應用于代謝組學分析及其他一些生化領域，在分析化學和藥物分析的分析方面運用也逐漸興起，因為在這些領域深入研究需要更高的分析精度。使用UPLC 質譜檢測器連接，對樣品分析，特別是中藥研究領域的發(fā)展將是一個極大的促進[7-11]。

當前對于氨基酸測定有許多種方法，其中主要有高效液相色譜法、氨基酸分析法和高效液相色譜質譜法三類。前兩個方法對樣品需要衍生化，分析效率低，分析時間長，樣品中的其他氨基酸容易影響谷氨酰胺的分離，這使得難以準確量化，也會帶來定量誤差[12-16]。運用UPLC-串聯(lián)質譜方法（UPLC-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測氨基酸，充分運用高效液相色譜法可分離復雜樣品的能力和質譜檢測法的高選擇性和靈敏度特點，在生物樣品中的應用具有優(yōu)勢[17-19]。本研究采用UPLC-MS/MS 對谷氨酰胺膠囊中谷氨酰胺含量進行測定，為此類產(chǎn)品質量控制和安全性評價提供方法。

1 儀器與試劑

LCMS-8050 島津三重四級桿質譜儀[島津企業(yè)管理（中國）有限公司/島津（香港）有限公司]，配備電噴霧離子源；LC-30A 島津超高效液相色譜儀（上海皖寧精密科學儀器有限公司）；色譜柱AtiantisT3 柱（1100mm×2 mm，3 μm）；SIL-30AC 自動進樣；CTO-20AC 柱溫箱；CBM-20A 系統(tǒng)控制器。谷氨酰胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量99.7%）；乙腈（色譜純）；甲酸（色譜純）。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Atiantis T3 柱（1100 mm×2 mm，3 μm），柱溫38℃，流動相以0.1%甲酸水溶液∶乙腈，流速0.30 mL/min，進樣量：1 μL，保留時間（tR）=1.3 min，理論塔板數(shù)N=2×104，分離度R=2。采用多反應監(jiān)測模式對谷氨酰胺膠囊中谷氨酰胺含量進行測定。

2.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；離子檢測方式：多反應監(jiān)測；離子極性：負離子；電噴霧離子源，離子源接口電壓：-3.0 kV；霧化氣：氮氣，3.0 L/min；干燥氣：氮氣，10 L/min；加熱氣：空氣，10 L/min；碰撞氣：氬氣；接口溫度：300℃。谷氨酰胺質譜分析條件參數(shù)如下：成分，谷氨酰胺；定量離子（m/z），146.10>128.26；Q1 Prerod bias（V），26；CE（V），15.0；Q3 Prerod bias（V），31.0。

2.3 對照品和供試品溶液制備

2.3.1 對照品溶液制備 谷氨酰胺對照品配制成濃度為0.1238、1.2380、4.9510、12.3800、19.7800、24.7700 μg/mL的對照品系列溶液。取樣品300 μL，加500 μL 乙腈沉淀蛋白，混勻后，上清液中谷氨酰胺濃度若不在對照品系列溶液濃度范圍內(nèi)，加水稀釋。

2.3.2 供試品溶液制備 精密稱取供試品適量，加流動相適量，超聲處理20 min 使溶解，用流動相定量稀釋成每毫升中含0.32 mg 的溶液，精密量取該溶液與內(nèi)標溶液各5 mL，置25 mL 量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即為供試品溶液。

3 結果

3.1 專屬性實驗

采用超高效液相色譜串聯(lián)質譜儀，色譜柱為Atiantis T3 柱（1100 mm×2 mm，3 μm），柱溫38℃。流動相以0.1%甲酸水溶液∶乙腈，流速0.30 mL/min，采用多反應監(jiān)測模式，按照“2.1 色譜條件”和“2.2 質譜條件”對谷氨酰胺膠囊中谷氨酰胺含量進行測定。

分別取空白溶液、對照品溶液和供試液各1 μL注入實驗儀器，根據(jù)上述儀器條件進行檢測，分別記錄總離子流圖。谷氨酰胺的保留時間為1.3 min，供試液中谷氨酰胺沒有受到其他成分的干擾。見圖1。

圖1 谷氨酰胺UPLC-MS/MS 總離子流圖

3.2 線性范圍和檢測限

分別取“2.3.1 項”下的谷氨酰胺對照品溶液，根據(jù)對照品濃度，取0.1238、1.2380、4.9510、12.3800、19.7800、24.7700 μg/mL 的對照品系列溶液進樣，繪制標準曲線時，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，線性回歸方程Y=4×10-6X+0.1336，相關系數(shù)為0.9998。谷氨酰胺在0.1232～24.7100 μg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系。

檢測限測定：分別取“2.3.1 項”下的谷氨酰胺對照品溶液用水稀釋，記錄谷氨酰胺濃度，確定檢測限為9.8 ng/mL。

3.3 加樣回收率試驗

分別取“2.3.2 項”下的谷氨酰胺樣品溶液6 份，按照“2.1 項”條件進樣測定，依據(jù)谷氨酰胺峰面積，計算峰面積相對標準偏差（RSD）為2.6%，結果表明該方法重復性良好。

加樣回收率試驗結果如表1，當理論濃度為61.86 μg/mL，平均加樣回收率為108.3%，RSD=2.2%。當理論濃度為123.68 μg/mL，平均加樣回收率為102.8%，RSD=3.2%。當理論濃度為206.16 μg/mL，平均加樣回收率為108.9%，RSD=4.8%。測得濃度為65.32 μg/mL，加樣回收率為105.5%。谷氨酰胺常用量在0.5～1.0 mmol/L 之間，加樣回收率試驗結果顯示，本方法能夠滿足谷氨酰胺測定的需要。

表1 加樣回收率試驗結果

3.4 樣品測試

分別取“2.3.2 項”下的谷氨酰胺膠囊樣品制備供試液6 份，按照“2.1 項”和“2.2 項”儀器條件進行測試，谷氨酰胺膠囊中谷氨酰胺平均含量為110.8 μg/mL。結果顯示，谷氨酰胺在范圍內(nèi)線性關系較好，RSD 為2.2%～4.8%，谷氨酰胺定量限為9.8 ng/mL。

4 討論

谷氨酰胺是白色結晶或晶性粉末，能溶于水，不溶于甲醇、乙醇、醚、苯、丙酮、氯仿和乙酸乙酯，無臭，稍有甜味。在中性溶液中不穩(wěn)定，在醇、堿或熱水中易分解成谷氨醇或丙酯化為吡咯羧醇，無臭，有微甜味。谷氨酰胺不是必需氨基酸，其在人體內(nèi)可由谷氨酸、纈氨酸、異亮氨酸合成。在疾病、營養(yǎng)狀態(tài)不佳或高強度運動等應激狀態(tài)下，機體對谷氨酰胺的需求量增加，以致自身合成不能滿足需要。谷氨酰胺是體內(nèi)重要的氨基酸，谷氨酰胺膠囊為硬膠囊，內(nèi)容物為白色或類白色顆粒狀粉未，用于改善胃潰瘍和十二指腸潰瘍的癥狀[20-22]。

目前，醫(yī)院使用高劑量的谷氨酰胺補劑來治療疾病：每天20 g 的劑量用于治療大腸炎、節(jié)段性回腸炎和腹瀉，每天40 g 的劑量用于艾滋病患者、進行化療的癌癥患者和燒傷患者。目前，許多醫(yī)院已經(jīng)開始對使用谷氨酰胺以縮短住院時間的效果進行研究，并且相信使用其作為出生體重較輕嬰兒的營養(yǎng)補充劑是安全的。研究表明[23]，糖尿病患者應當謹慎使用谷氨酰胺作為補劑，因為他們對谷氨酰胺的代謝過程異于常人。對癌癥患者使用谷氨酰胺作為補劑也有爭議。原因是谷氨酰胺有促進細胞快速分裂的作用，而細胞快速分裂正是腫瘤的特征。通過減慢身體代謝消耗并增強衰弱的免疫系統(tǒng)，谷氨酰胺能延長癌癥患者的壽命。谷氨酰胺對孕婦是否安全尚無統(tǒng)一定論，羊水中的谷氨酰胺水平很高，但并不知道母乳中的谷氨酰胺水平是否也較高。谷氨酰胺已靜脈輸予早產(chǎn)兒，并未發(fā)現(xiàn)不良反應。供給動物谷氨酰胺，可使母牛的產(chǎn)奶量增加一倍。如果一位孕婦要求用谷氨酰胺治療，那么保健人員就應對其進行評價，評估出恰當?shù)膭┝?。谷氨酰胺是體內(nèi)重要的氨基酸，盡管如此，服用過量氨基酸均會引起副作用的可能，谷氨酰胺也不例外，其應在保健人員的指導下服用。在保健人員的監(jiān)護下，每天服用40～50 g 的人在數(shù)周的時間內(nèi)尚未有不良反應[23-25]。

使用超高性能的液相色譜三重四級棒質譜法，分析谷氨酰胺膠囊中的谷氨酰胺含量，其特點為分離所需時間短，特異性強。即便谷氨酰胺不能在色譜柱中與其他氨基酸徹底分離，谷氨酰胺也不會受到檢測器中其他氨基酸的影響。對不含氨基酸需要進行標準化實驗處理，要簡化操作過程，提高定量精度，可顯著縮短實驗檢測時間。因此，建立了UPLC-MS/MS 測定谷氨酰胺含量，用于改善胃潰瘍和十二指腸潰瘍的癥狀，本方法操作簡單。

5 小結

作為腸動力的主要來源，谷氨酰胺對腸道內(nèi)膜的疾病有輔助療效。另外，其能逆轉由非類固醇抗炎藥對腸道所造成的損害。谷氨酰胺具有保護大腦防止氨中毒的功能，所以人們正在研究其對神經(jīng)變性疾病的功效。由于其沒有明顯的副作用，應對其予以足夠重視。谷氨酰胺具有保護大腦的功能，作為大腦的一種能量來源，谷氨酰胺能改善心情，增強智力，并有益于長期與短期記憶。

色譜-質譜聯(lián)用分析是一種高效互補的分離鑒定技術，使分離混合物、探索未知物及鑒定新化合物的在線聯(lián)用成為現(xiàn)實。本研究采用UHPLC-MS/MS 測定了谷氨酰胺膠囊中谷氨酰胺的含量，對該方法進行了驗證，為此類產(chǎn)品的質量控制和安全評價提供了一種檢測方法。本實驗建立了谷氨酰胺膠囊中谷氨酰胺的含量測定方法，結果顯示，本方法具有專屬性強，準確，靈敏，易于操作等優(yōu)點。本方法操作較簡單，方法專屬性、準確性及靈敏度良好，且測試時間短，可試用于藥物和生物樣品中谷氨酰胺含量的測定。