基于數(shù)據(jù)挖掘分析ZC3H13在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及預(yù)后意義

孫琰，方久遠(yuǎn)，李惠翔

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 病理科，河南 鄭州 450000)

腎細(xì)胞癌是起源于腎小管上皮的一組惡性腫瘤，約占腎臟惡性腫瘤的90%[1]。透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)、乳頭狀腎細(xì)胞癌(papillary renal cell carcinoma，PRCC)、嫌色細(xì)胞腎細(xì)胞癌(chromophobe renal cell carcinoma，CRCC)是3種常見的腎細(xì)胞癌亞型[2]。CRCC預(yù)后最好，PRCC次之，而占腎細(xì)胞癌70%～80%的ccRCC的預(yù)后最差。目前原發(fā)性ccRCC的5 a生存率為65%，但一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，5 a生存率下降至10%～20%[3]。隨著分子靶向治療的發(fā)展，腎細(xì)胞癌作為一組具有廣泛表型變異和瘤內(nèi)異質(zhì)性的疾病，有關(guān)預(yù)后和治療的基因研究顯得尤為重要[4-5]。ZC3H13是一種含有CCCH序列的鋅指蛋白，其特異性的鋅指結(jié)構(gòu)通過與靶點(diǎn)DNA或RNA序列相結(jié)合，影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。ZC3H13在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種進(jìn)程中行使不同的功能，與多種疾病和腫瘤相關(guān)。ZC3H13突變發(fā)生于肺癌、胃腸道腫瘤、卵巢癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤中，影響腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后[6-8]。Zhu等[9]在117例大腸癌患者中檢測到ZC3H13體細(xì)胞框架移位突變，并且發(fā)現(xiàn)該突變可能通過Ras-ERK信號通路影響預(yù)后。但ZC3H13在ccRCC中的表達(dá)及對預(yù)后的影響尚不明確。本研究利用Ualcan數(shù)據(jù)庫和HPA數(shù)據(jù)庫挖掘分析ZC3H13mRNA及蛋白在ccRCC中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系，并利用GEPIA數(shù)據(jù)庫加以驗(yàn)證，最后應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測ZC3H13在腎細(xì)胞癌中可能存在的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 Ualcan數(shù)據(jù)庫挖掘分析Ualcan數(shù)據(jù)庫(http://Ualcan.path.uab.edu/)是一個(gè)基于TCGA數(shù)據(jù)庫的癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘網(wǎng)站。本研究利用Ualcan數(shù)據(jù)庫挖掘分析ZC3H13在ccRCC中的表達(dá)并進(jìn)行差異性分析、生存分析和共表達(dá)分析，設(shè)置檢索條件為：(1)選擇scan by gene；(2)enter gene symbol輸入ZC3H13；(3)TCGA database選擇KIRC、KIRP、KICH。

1.2 HPA數(shù)據(jù)庫挖掘分析人類蛋白質(zhì)圖譜(Human Protein Atlas，HPA)數(shù)據(jù)庫(http://www.proteinatlas.org/)是一個(gè)基于蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的大型蛋白組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，包含上萬種人類蛋白質(zhì)的分布和表達(dá)信息，可以利用RNA測序和免疫組化分析腫瘤與正常組織之間的差異性表達(dá)。本研究利用HPA分析ccRCC組織及對照組織中ZC3H13蛋白的定位及表達(dá)情況。

1.3 GEPIA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證分析GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)是由北京大學(xué)所研發(fā)的用于基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的動(dòng)態(tài)分析數(shù)據(jù)庫。本研究利用GEPIA分析來自TCGA數(shù)據(jù)庫中ccRCC的RNA測序數(shù)據(jù)，進(jìn)行ZC3H13mRNA差異性分析、相關(guān)性分析及生存分析的驗(yàn)證。

1.4 STRING在線分析利用STRING在線數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)研究ZC3H13相關(guān)蛋白質(zhì)之間的相互作用。本研究檢索條件設(shè)置為：(1)選擇protein by name；(2)protein name輸入ZC3H13；(3)Organism選擇Homo sapiens。

2 結(jié)果

2.1ZC3H13mRNA在RCC中的表達(dá)相比正常腎臟組織，ZC3H13mRNA在腎細(xì)胞癌中呈低表達(dá)。Ualcan數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，在ccRCC、PRCC、CRCC中，ZC3H13mRNA表達(dá)水平均下調(diào)(P<0.05)，見圖1。GEPIA數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，相比正常腎組織，ZC3H13mRNA在ccRCC、PRCC、CRCC這3種亞型腎細(xì)胞癌中表達(dá)水平均下調(diào)(P<0.05)，見圖2。

A為ZC3H13 mRNA在ccRCC組織和正常腎臟組織中的表達(dá)水平比較，P=3.699×10-9；B為ZC3H13 mRNA在PRCC組織和正常腎臟組織中的表達(dá)水平比較，P=4.210×10-6；C為ZC3H13 mRNA在CRCC組織和正常腎臟組織中的表達(dá)水平比較，P=6.756×10-4；ccRCC為透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌；PRCC為乳頭狀腎細(xì)胞癌；CRCC為嫌色細(xì)胞腎細(xì)胞癌。

圖2 GEPIA數(shù)據(jù)庫中ZC3H13 mRNA在不同類型腎細(xì)胞癌中的表達(dá)情況

2.2ZC3H13mRNA在ccRCC中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系在ccRCC中，Ualcan數(shù)據(jù)庫按照性別、年齡、種族、腫瘤分期、腫瘤分級、腫瘤分型、轉(zhuǎn)移情況分組進(jìn)行ZC3H13mRNA表達(dá)的差異分析，結(jié)果顯示，ZC3H13mRNA的表達(dá)在ccRCC患者不同分期、腫瘤分型、組織學(xué)分級中存在差異。Ualcan數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示：Ⅰ期ccRCC患者ZC3H13mRNA表達(dá)水平高于Ⅲ期者(P<0.05)；ZC3H13mRNA在其他分期中的表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3A；與ccA型比較，ccB型ccRCC患者的ZC3H13mRNA表達(dá)水平較低(P<0.05)，見圖3B；ccRCC患者的組織學(xué)分級與ZC3H13mRNA的表達(dá)水平有關(guān)，相比于低組織學(xué)分級患者，具有高組織學(xué)分級患者的ZC3H13mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)，見圖3C。在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，隨著ccRCC腫瘤分期的增高，ZC3H13mRNA的表達(dá)量逐漸下降(P<0.05)，見圖4。

2.3ZC3H13mRNA在ccRCC中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系Ualcan數(shù)據(jù)庫挖掘性分析發(fā)現(xiàn)，在ccRCC中，與ZC3H13mRNA高表達(dá)組比較，ZC3H13mRNA低表達(dá)組生存期較短(P<0.05)，見圖5。GEPIA驗(yàn)證性分析發(fā)現(xiàn)，在ccRCC中，與ZC3H13mRNA高表達(dá)組比較，ZC3H13mRNA低表達(dá)組的總生存期和無瘤生存期下降(P<0.05)，見圖6。

A為不同腫瘤分期ccRCC的ZC3H13 mRNA表達(dá)情況；B為不同腫瘤分型ccRCC的ZC3H13 mRNA表達(dá)情況；C為不同組織學(xué)分級ccRCC的ZC3H13 mRNA表達(dá)情況。

圖4 GEPIA數(shù)據(jù)庫中ZC3H13 mRNA在不同腫瘤分期的ccRCC中的表達(dá)

圖5 Ualcan數(shù)據(jù)庫中ccRCC患者ZC3H13 mRNA表達(dá)水平與生存期的關(guān)系

A為ZC3H13 mRNA表達(dá)水平與ccRCC患者總生存期的關(guān)系；B為ZC3H13 mRNA表達(dá)水平與ccRCC患者無瘤生存期的關(guān)系。

2.4 ZC3H13蛋白在ccRCC中的定位HPA數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，在A-431腫瘤細(xì)胞系中，ZC3H13主要定位于核膜和肌動(dòng)蛋白絲。利用免疫組化抗體(HPA047806)分析ZC3H13在腎細(xì)胞癌和正常腎臟組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，ZC3H13蛋白主要表現(xiàn)為細(xì)胞核著色，部分胞質(zhì)輕微著色。

2.5ZC3H13基因的共表達(dá)分析首先利用Ualcan數(shù)據(jù)庫對ZC3H13進(jìn)行共表達(dá)分析，共檢索到6 394個(gè)共表達(dá)基因，其中包含VHL、PBRM1、mTOR、HIF-1α等在ccRCC發(fā)生過程中的關(guān)鍵基因。然后利用GEPIA數(shù)據(jù)庫對Ualcan數(shù)據(jù)庫中篩選出的共表達(dá)基因進(jìn)行相關(guān)性驗(yàn)證，結(jié)果表明ZC3H13與VHL、PBRM1、mTOR、HIF-1α等ccRCC多種關(guān)鍵基因呈正相關(guān)(P<0.05)，見圖7。

2.6 STRING在線分析利用STRING在線分析ZC3H13與上下游蛋白的相互作用，得到以ZC3H13為中心的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖8)。蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖主要包括WTAP、POLR2B、KIAA1429等11個(gè)基因，其中共涉及35個(gè)相互作用節(jié)點(diǎn)，P(PPI enrichmentP)=1.46×10-8。

A為ZC3H13與VHL的相關(guān)性分析；B為ZC3H13與PBRM1的相關(guān)性分析；C為ZC3H13與mTOR的相關(guān)性分析；D為ZC3H13與HIF-1α的相關(guān)性分析。

圖8 STRING在線分析以ZC3H13為中心的PPI網(wǎng)絡(luò)

3 討論

基因組的表觀遺傳修飾，如組蛋白修飾、RNA修飾和DNA甲基化，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[10]。m6A作為一種可逆的mRNA甲基化修飾，受多種調(diào)控因子及相關(guān)復(fù)合物的影響，是真核生物中最常見的內(nèi)部修飾方式，并在肝癌、肺癌、食管癌等多種腫瘤中發(fā)揮作用[11-12]。Chen等[13]研究發(fā)現(xiàn)，一些m6A甲基化調(diào)節(jié)劑在ccRCC中異常表達(dá)，并可作為ccRCC患者預(yù)后分層的潛在生物標(biāo)志物。ZC3H13是一種參與m6A修飾甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物形成的重要調(diào)控蛋白，定位于染色體13q14.13，與多種疾病和腫瘤相關(guān)。研究表明，ZC3H13通過C端與WTAP、Virilizer和Hakai的相互作用，參與m6A甲基化水平的調(diào)控，從而影響胚胎干細(xì)胞的自我更新過程[14]。ZC3H13在多種疾病中異常表達(dá)，如特發(fā)性血小板增多癥、精神分裂癥、膠質(zhì)瘤、胃腸道腫瘤等[15-17]。在結(jié)腸癌中，ZC3H13作為腫瘤抑制因子，可能作為上游調(diào)控因子參與Ras-ERK信號通路的調(diào)控，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和增殖。ZC3H13的表達(dá)下調(diào)與結(jié)腸癌患者的TNM分期和局灶淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[18]。由此推斷，ZC3H13可能在ccRCC中也存在差異性表達(dá)并可能影響患者預(yù)后。隨著高通量測序的發(fā)展，各種數(shù)據(jù)庫在醫(yī)學(xué)研究中的使用也越來越多。本研究利用來自TCGA數(shù)據(jù)庫的腫瘤基因芯片信息，通過Ualcan數(shù)據(jù)庫的挖掘和GEPIA數(shù)據(jù)庫的驗(yàn)證，初步發(fā)現(xiàn)ZC3H13mRNA在結(jié)直腸癌、腎癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中差異表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，在ccRCC、PRCC、CRCC這3種亞型的腎細(xì)胞癌中，ZC3H13mRNA的表達(dá)水平低于正常腎臟組織。在ccRCC中，ZC3H13mRNA低表達(dá)組具有較短的總生存期和無瘤生存期，由此推測ZC3H13mRNA低表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。此外，隨著腫瘤分期和組織學(xué)分級的遞增，ZC3H13mRNA表達(dá)水平呈下降趨勢，這說明ZC3H13mRNA的低表達(dá)提示著腫瘤細(xì)胞更高的惡性程度和侵襲性。相關(guān)研究曾確定了ccA和ccB兩者不同的ccRCC亞型[19]。既往文獻(xiàn)報(bào)道，相對于ccA患者，ccB患者具有更低的總體生存率、癌癥特異性生存率和無復(fù)發(fā)生存率[20]。在本研究進(jìn)行數(shù)據(jù)庫挖掘時(shí)發(fā)現(xiàn)，ccB亞型ZC3H13mRNA表達(dá)水平相對較低，這進(jìn)一步提示ZC3H13mRNA低表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)。在蛋白質(zhì)水平上，ZC3H13主要定位于細(xì)胞核膜和肌動(dòng)蛋白絲，在ccRCC中以低表達(dá)為主，這與mRNA水平結(jié)果相一致。

從遺傳學(xué)角度上來說，ccRCC來源于多個(gè)抑癌基因的相繼缺失，VHL的失活和染色體3p的缺失是最先被發(fā)現(xiàn)的致癌事件[21]。VHL基因位于染色體3p25.3上，與散發(fā)性ccRCC相關(guān)，約90%的ccRCC存在VHL基因缺失，其突變通常伴隨染色體3p的缺失[22-23]。VHL基因的缺失是ccRCC發(fā)生發(fā)展的早期事件，與腫瘤血管生成有關(guān)，是ccRCC發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵基因。在散發(fā)性ccRCC中，VHL基因的失活導(dǎo)致HIF-1α的異常表達(dá)，造成相關(guān)蛋白酶的降解，還會引起VEGF和PDGF表達(dá)水平上調(diào)而產(chǎn)生更多的新生血管[24]。在ccRCC患者中，HIF-1α的表達(dá)與腫瘤臨床分期和病理分級有關(guān)，其陽性表達(dá)組具有較低生存率和不良預(yù)后[25]。HIF-1α與胰腺癌、乳腺癌、ccRCC等多種腫瘤的預(yù)后相關(guān)[26-27]。這為腎細(xì)胞癌的治療提供了新的方向和靶點(diǎn)。PBRM1是與VHL位于同一條染色體臂上的基因，作為一個(gè)腫瘤雙重抑制基因，在約45%的ccRCC中發(fā)生突變[28]。PRBM1在腫瘤中低表達(dá)，是影響ccRCC預(yù)后的不良因素。在腎細(xì)胞癌中存在mTOR活性和自噬水平不同程度的升高。mTOR是一種氨基酸蛋白激酶，參與細(xì)胞的生長、代謝等多種生物學(xué)過程，也是mTOR信號通路中重要的調(diào)控因子。mTOR參與的PI3K-AKT-mTOR信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的衰老和能量代謝，并與ccRCC密切相關(guān)[29]。隨著免疫及靶向治療的興起，mTOR成為治療ccRCC的一個(gè)熱門靶點(diǎn)[30]。mTOR抑制劑在ccRCC患者中已取得了一定的療效，對改善患者預(yù)后具有重要意義[31]。本研究對ZC3H13基因進(jìn)行共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，VHL、PBRM1、mTOR、HIF-1α與ZC3H13共同表達(dá)于ccRCC中。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)ZC3H13與VHL、PBRM1、mTOR、HIF-1α存在明確的相關(guān)性。VHL、PBRM1、mTOR、HIF-1α是影響ccRCC發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的關(guān)鍵基因。ZC3H13是m6A甲基化的重要基因，其低表達(dá)與ccRCC的腫瘤分期、組織學(xué)分級等相關(guān)并影響患者的生存期。因此，推測ZC3H13是影響ccRCC患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物，對其進(jìn)一步研究有利于評估腎癌患者的預(yù)后。STRING在線分析結(jié)果顯示，ZC3H13與多種互作蛋白共同參與RNA代謝、mRNA甲基化、雄激素受體信號通路等生物學(xué)途徑，進(jìn)一步提示ZC3H13可能通過影響RNA修飾及甲基化等過程在ccRCC中發(fā)揮作用。

總之，利用生物信息學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)ZC3H13表達(dá)與ccRCC的臨床病理特征及生存期相關(guān)。ZC3H13低表達(dá)提示腫瘤細(xì)胞有更高的侵襲性和不良預(yù)后。ZC3H13作為與VHL、PBRM1、mTOR、HIF-1α等多種ccRCC的經(jīng)典基因相關(guān)的一個(gè)新基因，是未來評估ccRCC患者預(yù)后和靶向治療的潛在分子標(biāo)志物，這為患者的預(yù)后監(jiān)測和治療提供了新的方向。