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    親子鑒定中STR基因座來源不明突變的分析

    2021-03-09 11:50:02蘭菲菲丁紅珂陳延冰余麗華尹愛華
    檢驗醫(yī)學 2021年2期
    關(guān)鍵詞:親權(quán)親子鑒定基因座

    蘭菲菲, 丁紅珂, 陳延冰, 余麗華, 尹愛華

    (廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心,廣東 廣州 511442)

    短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat,STR)基因座作為重要的人類遺傳學標志,已被廣泛應用于人類遺傳學和法庭科學。近十幾年來,使用多個STR基因座的復合擴增試劑盒獲得個體的等位基因分型進行比對分析,是親子鑒定重要的檢測應用和研究方法之一。在實踐應用中,STR基因座等位基因的突變現(xiàn)象在國內(nèi)外均有報道[1-3],由于等位基因的突變對親權(quán)指數(shù)的正確計算、鑒定結(jié)論及親子鑒定的科學性均有不同程度的影響,本研究對發(fā)現(xiàn)的2個突變來源不明家系的突變基因座進行了分析,確定突變來源并探討突變基因座親權(quán)指數(shù)的計算方法。

    1 材料和方法

    1.1 研究對象

    選取2016—2018年廣東省婦幼保健院日常受理的4 385例親子鑒定案件及司法部的親子鑒定能力驗證考核案例,研究家系為生母、孩子和被檢父的三聯(lián)體親子鑒定或者父子/女、母子/女的二聯(lián)體親子鑒定。所有研究對象均簽署知情同意書。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 DNA提取 家系的血液和血卡樣本按照我國公安部發(fā)布的GA/T 383—2014《法庭科學DNA實驗室檢驗規(guī)范》[4]附錄A中的Chelex-100法常規(guī)提取基因組DNA。

    1.2.2 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增 取DNA提取液1 μL,應用Powerplex 21體系(美國Promega公司)進行20個常染色體STR基因座的多重PCR擴增。

    1.2.3STR基因座的等位基因分型 Powerplex 21體系包括D3S1358、D8S1179、D6S1043、Penta E、TPOX、D12S391等20個常染色體基因座,擴增片段范圍在500 bp內(nèi)。PCR擴增產(chǎn)物加入ILS500內(nèi)標(包含在Powerplex 21體系試劑盒內(nèi))后應用3500XL基因分析儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)進行毛細管電泳,標記每個STR基因座擴增片段的大小。按照Powerplex 21體系操作說明,將電泳數(shù)據(jù)與GeneMapper ID-X軟件(美國應用生物系統(tǒng)公司)中預設的Powerplex 21體系提供的Ladder中每個STR基因座等位基因的片段大小進行比對,獲得被檢測樣本STR基因座的等位基因分型。

    1.3 突變來源的研究

    1.3.1STR基因座突變的確定 2個家系應用Powerplex 21體系檢測發(fā)現(xiàn),孩子的基因座出現(xiàn)不符合遺傳規(guī)律的現(xiàn)象,對不符合遺傳規(guī)律的家系分別采用Microreader 23sp ID體系(蘇州閱微基因技術(shù)有限公司)和Identifiler體系(美國應用生物系統(tǒng)公司)確定D12S391、D8S1179和TPOX基因座發(fā)生的突變。

    1.3.2 突變STR基因座的測序 針對發(fā)生突變的STR基因座,查詢UCSC數(shù)據(jù)庫(http://genome.ucsc.edu) 中基因座的序列信息,設計引物進行單基因座的PCR擴增,引物序列見表1。擴增條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35個循環(huán);72 ℃后延伸5 min。對PCR擴增后的產(chǎn)物進行測序分析。

    表1 單基因座擴增引物

    1.3.3 突變STR基因座的親權(quán)指數(shù)計算 按照GB/T 37223—2018《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》[5]中三聯(lián)體不符合遺傳規(guī)律的親權(quán)指數(shù)計算方法,計算突變STR基因座的親權(quán)指數(shù)。

    2 結(jié)果

    2.1 STR基因座的突變情況

    Powerplex 21體系檢測結(jié)果顯示有2個家系發(fā)生了STR基因座等位基因的突變。見表2。

    經(jīng)過Microreader 23sp ID體系和Identifiler體系的檢測驗證,發(fā)現(xiàn)2個家系發(fā)生了STR基因座等位基因突變,其中一個家系的突變發(fā)生在D12S391基因座,另一個家系的突變發(fā)生在TPOX基因座和D8S1179基因座。見表2、圖1。3個基因座的突變來源均不能明確。

    圖1 D12S391、D8S1179和TPOX基因座等位基因分型圖譜

    表2 突變基因座在不同檢測體系的等位基因分型結(jié)果

    2.2 突變STR基因座的測序分析

    對D12S391、TPOX單基因座擴增后的測序分析發(fā)現(xiàn),2個家系中孩子在D12S391基因座和TPOX基因座的突變來源于母親。D12S391基因座中,孩子的等位基因18由母親的等位基因19突變而來,孩子的等位基因21來源于父親。TPOX基因座中,孩子的等位基因10由母親的等位基因11突變而來,孩子的等位基因8來源于父親。見圖2、圖3。

    圖2 D12S391基因座突變等位基因的序列分析

    圖3 TPOX基因座中孩子等位基因10突變的序列分析

    2.3 親權(quán)指數(shù)計算

    根據(jù)GB/T 37223—2018《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》[5]中三聯(lián)體不符合遺傳規(guī)律的親權(quán)指數(shù)計算方法和測序結(jié)果分析確定的等位基因突變來源,計算3個突變STR基因座的親權(quán)指數(shù)如下:D12S391親權(quán)指數(shù)=X/Y=μm/(4p18);TPOX親權(quán)指數(shù)=X/Y=μm/(2p10);D8S1179親權(quán)指數(shù)=X/Y=μf/(4p17);式中X為假設被檢測個體遺傳表型是孩子生物學父親的概率,Y為假設隨機個體遺傳表型是孩子生物學父親的概率,μm為女性突變率,μf為男性突變率。

    3 討論

    親子鑒定中STR基因座發(fā)生突變的現(xiàn)象比較常見,平均突變率為2‰[6],主要發(fā)生機制是核心重復序列出現(xiàn)復制滑動或錯配[7]。在親子鑒定實踐中遇到突變現(xiàn)象時,首先要確定突變的真實性,特別是遇到只有單峰的看似為“純合子”,但峰高卻與雜合子相近的等位基因分型時,考慮突變STR基因座是否存在等位基因丟失或其他異常現(xiàn)象。面對這種情況,可以選擇應用不同檢測試劑盒檢測比對突變基因座的等位基因分型情況進行確定。在生母、孩子和被檢父的三聯(lián)體親子鑒定中,是在母親為生物學母親的前提下,檢測被檢父是否為孩子的生物學父親。如果被檢父是孩子的生物學父親,根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律,孩子STR基因座的2個等位基因一個來自于母親,另一個來自于被檢父,可以在被檢父的STR基因座中找到來源。如果在檢測的多個STR基因座中遇到1個或2個不符合孟德爾遺傳規(guī)律的情況,即孩子STR基因座中的1個等位基因無法在被檢父的STR基因座中找到來源,那么考慮該STR基因座發(fā)生了父源性突變。根據(jù)突變情況計算該基因座的親權(quán)指數(shù),在親子鑒定中父源性突變較為常見。但如果出現(xiàn)孩子個別STR基因座中的1個等位基因無法在生物學母親的STR基因座中找到來源時,則考慮該STR基因座發(fā)生了母源性突變。有時還會出現(xiàn)孩子STR基因座難以確定突變來源即突變來源不明的情況。由于父源性突變與母源性突變在計算STR基因座的親權(quán)指數(shù)時應用的突變系數(shù)和計算公式不同,所以可能會影響親子鑒定的結(jié)論。本研究分析了在鑒定實踐中遇到的2個家系的3個STR基因座不明突變的來源,涉及其父源性突變或母源性突變的確定及親權(quán)指數(shù)計算。本研究對發(fā)現(xiàn)的突變基因座分別應用Microreader 23sp ID體系或Identifiler體系進行驗證,發(fā)現(xiàn)與Powerplex 21體系檢測到的等位基因分型一致。

    本研究中D12S391基因座如果考慮父源性突變有2種情況:一步突變(孩子的等位基因18,21:21來自母親,18由父親的17突變而來)或三步突變(21來自母親,18由父親的21突變而來);如果考慮母源性突變同樣有2種情況:一步突變(孩子的等位基因18,21:21來自父親,18由母親的19突變而來)或三步突變(21來自父親,18由母親的21突變而來)。TPOX基因座如果考慮為母源性突變?yōu)橐徊酵蛔儯ê⒆拥牡任换?,10:8來自父親,10由母親的11突變而來),考慮父源性突變則為兩步突變(孩子的等位基因8,10:8來自母親,10由父親的8突變而來)。D8S1179基因座如果考慮為母源性突變?yōu)樗牟酵蛔儯ê⒆拥牡任换?5,17:15來自父親,17由母親的13突變而來),考慮父源性突變則為一步突變(孩子的等位基因15,17:15來自母親,17由父親的18突變而來)。逐步突變模式理論認為,90%的STR基因座突變?yōu)橐徊酵蛔?,且父系來源的突變率較母系來源的突變率高,約為3.5∶1[8-9]。如果按逐步突變理論進行推理,首先考慮突變步數(shù)絕大多數(shù)為一步突變,本研究中的TPOX基因座應考慮為母源性突變,D8S1179基因座應考慮為父源性突變,D12S391基因座父源性突變和母源性突變均有可能。單基因座擴增測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),D12S391基因座孩子等位基因18的突變來源于母親,由母親的等位基因19突變而來,為母源性一步突變,等位基因21來源于父親。TPOX基因座孩子等位基因10的突變來源于母親,由母親的等位基因11突變而來,為母源性一步突變。D12S391和TPOX基因座均符合逐步突變模式理論。根據(jù)GB/T 37223—2018《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》[5]中三聯(lián)體不符合遺傳規(guī)律的親權(quán)指數(shù)計算方法和測序結(jié)果分析確定的等位基因突變來源,計算3個突變STR基因座的親權(quán)指數(shù)如下:D12S391親權(quán)指數(shù)=X/Y=μm/(4p18);TPOX親權(quán)指數(shù)=X/Y=μm/(2p10);D8S1179親權(quán)指數(shù)=X/Y=μf/(4p17)。如果沒有進行測序確定等位基因突變的來源,則可以考慮按照的逐步突變理論,首先考慮一步突變,D12S391基因座親權(quán)指數(shù)=X/Y=(μf+μm)/4p18,TPOX和D8S1179基因座親權(quán)指數(shù)的計算方式與上述相同。

    STR基因座的等位基因突變現(xiàn)象較為常見,由于突變基因座的親權(quán)指數(shù)計算對親子鑒定的累積親權(quán)指數(shù)(cumulative parental index,CPI)計算有較大影響,從而影響鑒定結(jié)論的科學性。尤其當0.000 1<CPI<10 000時,對于得出“肯定”或者“排除”的結(jié)論具有重要影響。因此,遇到突變時應首先驗證突變的真實性,進而確定突變的來源,從而正確計算突變基因座的親權(quán)指數(shù),得出科學、正確的鑒定結(jié)論。

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