巨噬細胞增強宮頸癌細胞對SN-38的抗性

賴麗梨，靳 煥，段華英，鄒爭志*

(1. 廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 511300； 2. 華南師范大學生物光子學研究院激光生命科學研究所暨激光生命科學教育部重點實驗室，廣州 510631； 3. 廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510260)

宮頸癌是導致女性癌癥死亡的主要原因之一. 在世界范圍內(nèi)，宮頸癌是女性中第四大最常見的惡性腫瘤，該疾病對婦女生命安全與健康構(gòu)成了嚴重威脅. 致癌性人類乳頭瘤病毒(HPV)類型持續(xù)感染是引發(fā)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要原因[1-2]. 此外，遺傳因素、環(huán)境因素及原癌基因的突變等非HPV病毒感染也可能會發(fā)展為宮頸癌[3]. 現(xiàn)階段，對于宮頸癌的治療取決于診斷時的疾病程度和當?shù)乜色@得的資源，可能涉及化療、放療以及子宮切除手術(shù)等方式.

SN-38是伊立替康鹽酸鹽(CPT-11)的一種活性代謝物，能夠抑制DNA拓撲異構(gòu)酶I及DNA合成，并且造成頻繁的DNA單鏈斷裂，是臨床上常用的治療腫瘤化療藥[4]. 已有研究表明：SN-38在具有不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細胞系中，能抑制細胞增殖及轉(zhuǎn)移,與自噬抑制劑氯喹聯(lián)合使用能夠顯著降低結(jié)腸癌細胞的活性[5-7]，并且能抑制胰腺癌、胃癌及三陰性乳腺癌進展，增加患者存活率[8-10]. 此外，對宮頸癌細胞的研究[11]表明：SN-38可以通過p53途徑誘導HeLa和SiHa細胞凋亡，與順鉑或奈達鉑聯(lián)合使用情況下能達到很高的抗腫瘤功效，并對復發(fā)性宮頸癌患者也有一定程度的緩解[12-13]. 然而，在宮頸癌治療的過程中，患者對SN-38不敏感或在治療過程中產(chǎn)生耐藥性是造成復發(fā)轉(zhuǎn)移、預后差的重要因素. 因此，研究宮頸癌化療耐藥的相關(guān)機制,對克服宮頸癌患者的不良預后以及延長患者生存期具有重要意義.

巨噬細胞(MΦ)在實體瘤中所占比例高達30%～50%，這也充分說明了巨噬細胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲以及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用. 此外，巨噬細胞還能夠抑制多種常規(guī)治療(包括化療、放療)的效果[14-15]. 越來越多的證據(jù)表明：巨噬細胞與宮頸癌化療耐藥及預后不良緊密相關(guān). 然而，巨噬細胞促進宮頸癌細胞抵抗SN-38的研究尚未報道. 本研究旨在探討腫瘤相關(guān)的巨噬細胞在宮頸癌細胞對SN-38敏感性中的作用，為臨床宮頸癌治療提供新的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試劑

佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-aceteat, PMA)(貨號：P1585；工作質(zhì)量濃度：20 ng/mL)，DMSO購買于Sigma公司；CCK8檢測試劑盒，胰蛋白酶消化液購買于Thermo Scientific公司；RNAiso Plus購買于TaKaRa公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit和SYBR Green購買于TOYOBO公司.

1.2 細胞培養(yǎng)

人宮頸癌細胞系HeLa、CaSki、C-33A和SiHa(購于中科院上海細胞庫)置于含10%胎牛血清(Gbico)的DMEM培養(yǎng)基中，THP-1置于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，經(jīng)檢測無支原體污染.

1.3 THP-1誘導分化為巨噬細胞

將1×106個人源單核細胞THP-1種于6孔板，每孔添加PMA使其終質(zhì)量濃度為20 ng/mL，培養(yǎng)72 h后去除未貼壁細胞，貼壁細胞即為巨噬細胞[16].

1.4 細胞增殖檢測

取對數(shù)生長期細胞用胰酶消化后，按照每孔200 μL細胞懸液含10 000個細胞的密度接種于96孔板中. 細胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待完全貼壁后(至少8 h)，每孔補加SN-38使其終質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL. 腫瘤相關(guān)巨噬細胞條件性培養(yǎng)液和新鮮DMEM按照1∶1的比例添加到宮頸癌細胞中. 同時設空白對照組(沒有細胞，僅有等體積培養(yǎng)基). 待細胞培養(yǎng)至24、48 h，按照CCK-8檢測試劑盒說明書步驟完成細胞增殖檢測. 簡單的流程如下：試驗中止前4 h加入CCK-8液20 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1 h在酶聯(lián)檢測儀上檢測450 nm 波長下每孔的OD (Optical Density, OD)值，根據(jù)公式求出細胞活力. 細胞活力(Cell Viability)=[(試驗組)-(空白對照組)]/[(對照組)-(空白對照組)][17].

1.5 熒光定量PCR

THP-1通過PMA刺激誘導分化為巨噬細胞. 將巨噬細胞與對SN-38相對不敏感的HeLa和SiHa細胞共培養(yǎng)，通過熒光定量PCR檢測巨噬細胞中HLA-DR、CD80、CD206、CD163和ARG1的mRNA水平. 按照制造商的說明，用RNAiso Plus提取總RNA. 然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將獲取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA. 按照SYBR Green PCR試劑盒試驗步驟在CFX ConnectTM實時系統(tǒng)上檢測HLA-DR、CD80、CD206、ARG1和CD163的表達. 并根據(jù)2-△△Ct算法計算倍數(shù)變化.β-Actin作為內(nèi)參. 表1列出了用于PCR試驗中使用的引物.

表1 引物的名稱和序列Table 1 The names and sequences of the primers

1.6 分析宮頸癌細胞系對藥物敏感性

通過在線軟件Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC)(https://www.cancerrxgene.org/celllines)[18]，分析數(shù)據(jù)庫中8種宮頸癌細胞系對310多種化療藥或小分子靶向藥的敏感性. Dataset選擇GDSC1.

1.7 統(tǒng)計學分析

試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有試驗均獨立重復3次，計量資料采用平均值±標準差表示，數(shù)據(jù)的比較分析采取student’t檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義[19].

2 結(jié)果與分析

2.1 宮頸癌細胞系對化療藥的敏感性分析

為了評估不同宮頸癌細胞系對臨床化療藥的敏感性，通過GDSC在線軟件，分析了數(shù)據(jù)庫中所有宮頸癌細胞系(共8種，分別是HeLa、DoTc2-4510、CaSki、HT-3、CAL-39、C-33A、ME-180和SiHa)對310多種化療藥敏感性數(shù)據(jù). 結(jié)果如圖1所示，橫坐標代表不同種類藥物，縱坐標指示的是將各藥物的半抑制質(zhì)量濃度(IC50)值進行Z分數(shù)(Z-score)數(shù)據(jù)標準化后的值，藍色箭頭所指的是SN-38代表的數(shù)值點. IC50Z-score越小，代表該藥物在這種癌細胞中的半抑制質(zhì)量濃度越低，即癌細胞對藥物越敏感. 從結(jié)果(圖1)可以看出：CaSki和C-33A細胞對大多數(shù)化療藥都具有很高的敏感性，而SiHa細胞對少數(shù)化療藥敏感.

2.2 宮頸癌細胞系對SN-38的敏感性分析

本研究通過分析以上8個細胞系和310多種藥物，發(fā)現(xiàn)SN-38在HeLa、CaSki、ME-180、HT-3、C-33A和SiHa細胞中的IC50Z-score都很小. IC50Z-score小于-1.5大于-2代表癌細胞對該藥物敏感，小于-2代表極敏感. 本研究(圖2)發(fā)現(xiàn)：CaSki、ME-180、HT-3、C-33A對SN-38都極為敏感. HeLa和SiHa這2種宮頸癌細胞系對SN-38敏感(圖2). 而CAL-39對SN-38最不敏感.

圖1 宮頸癌細胞系對化療藥的敏感性

圖2 宮頸癌細胞系對SN-38的敏感性

2.3 SN-38對宮頸癌細胞系增殖的影響

為了進一步探討SN-38對不同類型宮頸癌細胞系增殖的影響，選取了HPV-18陽性HeLa細胞、HPV-16陽性SiHa和CaSki細胞，以及HPV陰性C-33A細胞作為研究的細胞模型，在0、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL的SN-38作用細胞24、48 h后，完成CCK8試驗檢測細胞活力(圖3). 結(jié)果顯示：在加入SN-38的24 h后(圖3A)，隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，細胞活力逐漸減弱，除SiHa細胞在SN-38質(zhì)量濃度大于0.4 μg/mL才有顯著性差異外，HeLa、CaSki和C-33A細胞在SN-38質(zhì)量濃度大于0.2 μg/mL時就都具有顯著性差異；HeLa和SiHa細胞相對于CaSki及C-33A細胞對于SN-38有一定程度的抵抗性. 對SN-38在這4種宮頸癌細胞系的IC50分析(圖4)發(fā)現(xiàn)：HeLa和SiHa細胞的IC50明顯大于CaSki和C-33A細胞. 同樣，在加入SN-38的48 h后(圖3B)，細胞活力顯著減弱，HeLa和SiHa細胞相對于CaSki及C-33A細胞對SN-38具有較強的抵抗性，并且HeLa和SiHa細胞對于SN-38的IC50也明顯大于CaSki及C-33A細胞(圖4). 以上試驗結(jié)果表明：CaSki和C-33A相對于HeLa和SiHa細胞對SN-38更敏感，與數(shù)據(jù)庫分析的結(jié)果一致.

圖3 HeLa、CaSki、C-33A和SiHa細胞加入SN-38 24 、48 h后的細胞活力

圖4 在HeLa、CaSki、C-33A和SiHa細胞加入SN-38 24、48 h的IC50

2.4 宮頸癌細胞系誘導巨噬細胞成腫瘤相關(guān)巨噬細胞的研究

以上的研究結(jié)果表明宮頸癌細胞系對SN-38普遍比較敏感，然而SN-38在臨床上對宮頸癌病人的治療效果卻不是很理想，其中的原因尚不清楚. 已有報導[20]表明腫瘤相關(guān)巨噬細胞能夠普遍增強癌細胞對化療藥物的抵抗. 因此，本研究檢測是否腫瘤相關(guān)巨噬細胞增強了宮頸癌細胞對SN-38的抵抗. 圖5A顯示：與對照組相比，在巨噬細胞與HeLa細胞共培養(yǎng)后，巨噬細胞中促炎性相關(guān)基因HLA-DR和CD80的mRNA水平明顯下降，而抑炎性相關(guān)基因CD206、CD163和ARG1的mRNA水平顯著升高. 同樣，在巨噬細胞與SiHa細胞共培養(yǎng)后，能明顯下調(diào)巨噬細胞中HLA-DR和CD80的mRNA水平，上調(diào)CD206、CD163和ARG1的mRNA水平(圖5B). 以上結(jié)果說明，HeLa和SiHa細胞誘導巨噬細胞向M2型極化. M2型極化是腫瘤相關(guān)巨噬細胞的一個重要的特征，以上結(jié)果表明HeLa和SiHa細胞成功誘導THP-1巨噬細胞成為腫瘤相關(guān)巨噬細胞.

圖5 宮頸癌細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)48 h后巨噬細胞中HLA-DR、CD80、CD206、CD163和ARG1的 mRNA水平

2.5 腫瘤相關(guān)巨噬細胞對宮頸癌細胞抵抗SN-38的影響

將THP1來源的巨噬細胞誘導分化為M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞之后，收集腫瘤相關(guān)巨噬細胞上清液培養(yǎng)聯(lián)合SN-38處理相對不敏感的HeLa和SiHa細胞，通過CCK-8試驗檢測了細胞的增殖能力. 將腫瘤相關(guān)巨噬細胞條件性培養(yǎng)液作用HeLa細胞24、48 h后，細胞活力相對于對照組略有增加(圖6A)，但差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05). 在加入不同質(zhì)量濃度SN-38后，能顯著抑制HeLa細胞增殖，然而在添加腫瘤相關(guān)巨噬細胞條件性培養(yǎng)液組能夠顯著緩解SN-38對細胞活力的抑制作用. 同樣，在SiHa細胞中也觀察到相同的結(jié)果. SN-38能夠顯著降低SiHa細胞活力，而腫瘤相關(guān)巨噬細胞條件性培養(yǎng)液能夠在很大程度上減弱SN-38對SiHa細胞活力的抑制作用(圖6B). 以上結(jié)果說明腫瘤相關(guān)巨噬細胞促進宮頸癌細胞對SN-38抵抗.

圖6 宮頸癌細胞經(jīng)巨噬細胞條件培養(yǎng)液(CM)處理，同時加入SN-38處理24、48 h后的細胞活力

3 討論

巨噬細胞主要參與腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應，根據(jù)其表型可分為M1型與M2型. M1型巨噬細胞表面會高表達HLA-DR、CD80和CD86，在腫瘤微環(huán)境釋放促炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α等，進而將腫瘤細胞殺傷. M2型巨噬細胞會高表達ARG1、CD163和CD206等，可分泌免疫抑制因子IL-10、TGF-β、和VEGF等，促進腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移、免疫抑制及化療抵抗[21]. 近年來，人們對宮頸癌中巨噬細胞的研究較多，并且臨床病理和試驗研究均表明：腫瘤相關(guān)巨噬細胞在宮頸癌的進展中起關(guān)鍵作用[22]. 本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞促進了宮頸癌細胞對SN-38的抵抗，因而靶向巨噬細胞及其與宮頸癌之間的聯(lián)系可以作為宮頸癌治療的潛在靶點，但沒有深入探究機制. 因此，接下來需要進一步去探索巨噬細胞促進宮頸癌細胞抵抗SN-38的分子機制.

PI3K/Akt信號通路在宮頸癌細胞增殖、侵襲的過程中起著重要作用[23]. 一些抗腫瘤藥物的使用能明顯抑制宮頸癌細胞PI3K/Akt信號進而阻滯細胞周期，觸發(fā)細胞凋亡[24]. 在宮頸癌細胞系已表明：SN-38下調(diào)了p-Akt的蛋白表達，并上調(diào)了p53和p21的蛋白表達. 將Akt在宮頸癌細胞系中過表達會導致SN-38誘導的細胞凋亡明顯減少，這表明Akt信號在宮頸癌抵抗SN-38的過程中起重要作用[11]. 研究表明：腫瘤相關(guān)巨噬細胞促進腫瘤抵抗化療過程，會分泌14-3-3ζ蛋白，可激活胰腺癌中Akt信號，促進胰腺癌化學耐藥性[25]. 在乳腺癌中研究發(fā)現(xiàn)：腫瘤相關(guān)的巨噬細胞分泌CCL2，通過激活乳腺癌中PI3K/Akt/mTOR信號誘導他莫昔芬耐藥[26]. 另外，巨噬細胞分泌的CCL12激活PI3K/Akt信號賦予大腸癌對5-氟尿嘧啶抗性[27]. 這些結(jié)果表明巨噬細胞很可能是通過增強了宮頸癌細胞中的Akt信號降低其對SN-38的敏感性.

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)CaSki、ME-180、HT-3、C-33A對SN-38都極敏感，HeLa和SiHa對SN-38敏感，而CAL-39對SN-38不敏感. 巨噬細胞顯著抑制HeLa和SiHa宮頸癌細胞對SN-38的敏感性. 總之，本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞能夠降低宮頸癌細胞對SN-38的敏感性.