酸棗仁皂苷B通過(guò)調(diào)節(jié)自噬抑制血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移

嵇再雄， 李家祺， 王建波

血管介入術(shù)是治療危重肢體缺血的有效方法，但其遠(yuǎn)期成功仍受到術(shù)后高發(fā)再狹窄影響［1］。糖尿病引起的下肢動(dòng)脈病變管徑小且時(shí)間長(zhǎng)，術(shù)后遠(yuǎn)期效果更加不理想［2］。藥物洗脫支架可防止再狹窄［3］，但術(shù)后血管愈合延遲和晚期血栓形成風(fēng)險(xiǎn)增加使之并不能成為再狹窄長(zhǎng)遠(yuǎn)解決方案［4-5］。介入操作無(wú)可避免地?fù)p傷動(dòng)脈內(nèi)膜，內(nèi)膜撕裂可導(dǎo)致膠原暴露和持續(xù)性炎癥。血管損傷血小板、炎性細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）釋放血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF），刺激其發(fā)生去分化。PDGF可與PDGF受體（PDGFR）α或β結(jié)合，激活PI3K/Akt、MAPK等多條 信 號(hào) 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 通 路，導(dǎo) 致VSMC增 殖 和 遷 移［6］，而VSMC過(guò)度增殖和遷移是血管介入術(shù)后再狹窄的主要原因。目前針對(duì)血管新內(nèi)膜增生和再狹窄的臨床藥理學(xué)干預(yù)仍不令人滿意，尋找更有效藥物防治再狹窄及闡明其潛在機(jī)制仍具挑戰(zhàn)。酸棗仁是亞洲國(guó)家著名傳統(tǒng)藥物，具有催眠鎮(zhèn)定、抗焦慮、抗氧化應(yīng)激等功能［7-8］。酸棗仁皂苷B（jujuboside B，JuB）作為天然皂苷三萜類(lèi)化合物，是酸棗仁中主要生物活性成分之一［9］。研究表明JuB具有抗血小板聚集［10］、誘導(dǎo) 腫 瘤 細(xì) 胞 自 噬 和 凋 亡［11］、降 低 血 管 張 力［12］、抗 炎癥［13］等作用，然而JuB對(duì)血管介入術(shù)后VSMC增殖和遷移的潛在影響仍未知。本研究旨在對(duì)JuB在VSMC生理調(diào)節(jié)中的作用及其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑

JuB（高效液相色譜法檢測(cè)純度≥98%，化學(xué)結(jié)構(gòu)C52H84O21，分子量1045.223，上海貝吉斯生物科技中心）；高糖Dulbecco改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、乙二胺四乙酸（EDTA）-胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；重組人PDGF-BB（美國(guó)R&D公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK）-8（上海翊圣生物科技公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

將大鼠胸大動(dòng)脈VSMC——A7r5（中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）置于含10%FBS的DMEM并于37℃、5%CO2濕潤(rùn)條件下培養(yǎng)。取3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。25 ng/mL PDGF-BB刺激A7r5建立損傷模型。實(shí)驗(yàn)分為5組：正常對(duì)照（NC）組、PDGF-BB組、JuB（10μmol/L）＋PDGF-BB組、JuB（25μmol/L）＋PDGF-BB組、JuB（50μmol/L）＋PDGFBB組。

1.3 CCK-8測(cè)定

將5×103個(gè)A7r5種入96孔板每孔中，并在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜以貼壁。細(xì)胞達(dá)到70%時(shí)，吸出培養(yǎng)基，用PDGF-BB（25 ng/mL）和JuB（0、1、10、25、50、100μmol/L）分別處理細(xì)胞；向每孔中補(bǔ)充CCK-8溶液10μL，將樣品于37°C下孵育2 h；用SpectraMax i3x型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）于450 nm下測(cè)試細(xì)胞光密度（OD）；基于對(duì)照的百分比計(jì)算細(xì)胞活性（%）。每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。

1.4 劃痕愈傷實(shí)驗(yàn)

將A7r5接種在12孔板中，培養(yǎng)至80%密度，置于含PDGF-BB（25 ng/mL）或JuB（50μmol/L）培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；用20μL移液管尖在平板上劃出一道筆直劃痕，24 h后用倒置顯微鏡（×50，德國(guó)Leica公司）拍攝傷口，采用ImageJ 1.53a版圖像處理軟件（美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院）并根據(jù)恢復(fù)面積百分比分析細(xì)胞遷移程度。遷移指數(shù)＝實(shí)驗(yàn)組遷移距離/對(duì)照組遷移距離。

1.5 免疫印跡檢測(cè)

將A7r5接種在6孔板中，細(xì)胞達(dá)到70%～80%時(shí)用PDGF-BB和/或JuB處理各組細(xì)胞；用裂解緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)公司）從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)樣品，提取液于4℃、12 000轉(zhuǎn)離心20 min，取上清液，用二辛可酸（BCA）蛋白質(zhì)分析試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）評(píng)估蛋白質(zhì)樣品濃度；按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程處理獲得等體積等量蛋白質(zhì)樣品；經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）膠（10%分離膠）電泳后，樣品中蛋白條帶被分離，行聚偏二氟乙烯（PVDF）（美國(guó)Millipore公司）轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶封閉膜上非特異性結(jié)合位點(diǎn)1 h，膜與一抗在搖床上4℃孵育12 h，所用一抗為小鼠抗增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）單抗（美國(guó)CST公司，1∶1 200稀釋?zhuān)?、兔抗LC3B單抗（英國(guó)Abcam公司，1∶1 200稀釋?zhuān)?；將膜與二抗在搖床上室溫孵育1 h，所用二抗為抗兔二抗（上海碧云天生物技術(shù)公司，1∶1 500稀釋?zhuān)⒖剐∈蠖梗ㄉ虾９谔┥锟萍脊荆?∶40 000稀釋?zhuān)?；洗?次后，用超敏顯影液（南京諾唯贊生物科技公司）和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光可視化所得目的條帶，根據(jù)條帶灰度值用ImageJ 1.53a版軟件作半定量分析。β-微管蛋白（tubulin）作為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得至少通過(guò)3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 JuB抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的A7r5增殖

各濃度（0～100μmol/L）JuB預(yù)處理A7r5 24 h，再用PDGF-BB（25 ng/mL）刺激24 h，結(jié)果顯示JuB呈濃度依賴(lài)性顯著抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的A7r5增殖；與正常對(duì)照組相比，25 ng/mL PDGF-BB處理后A7r5增殖能力顯著增加，而5～100μmol/L JuB預(yù)處理顯著降低PDGF-BB誘導(dǎo)的A7r5增殖能力，見(jiàn)圖1。由于JuB在100μmol/L作用濃度時(shí)細(xì)胞活力低于正常對(duì)照組，后續(xù)選用10、25、50μmol/L JuB進(jìn)行多劑量實(shí)驗(yàn)。免疫印跡法檢測(cè)增殖標(biāo)記物PCNA蛋白顯示，PDGF-BB（25 ng/mL）顯著誘導(dǎo)PCNA表達(dá)（P＜0.001）；與PDGF-BB組相比，JuB預(yù)處理呈濃度依賴(lài)性顯著降低PCNA表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖1 不同濃度JuB對(duì)A7r5活力的影響

2.2 JuB減弱PDGF-BB誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞遷移

劃痕愈傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，PDGF-BB刺激24 h顯著縮小劃痕開(kāi)口（P＜0.001）；相比于PDGF-BB刺激組，10、25、50μmol/L JuB預(yù)處理可呈劑量依賴(lài)性顯著抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞遷移，見(jiàn)圖3。

圖2 各組A7r5 PCNA相對(duì)表達(dá)量

圖3 24 h時(shí)各組A7r5細(xì)胞遷移情況（倒置顯微鏡，×50）

2.3 JuB逆轉(zhuǎn)PDGF-BB誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞自噬

免疫印跡法檢測(cè)自噬的分子標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3，LC3）B蛋白，結(jié)果顯示A7r5細(xì)胞LC3B蛋白表達(dá)在PDGF-BB組顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.001），提示PDGF-BB激活A(yù)7r5細(xì)胞自噬；PDGF-BB+JuB組顯著低于PDGF-BB組，表明JuB可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞自噬，見(jiàn)圖4。

3 討論

新內(nèi)膜增生是血管介入術(shù)后再狹窄的關(guān)鍵進(jìn)程［14］。VSMC過(guò)度增殖和遷移在新內(nèi)膜增生發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，因此抑制VSMC異常增殖和遷移對(duì)預(yù)防再狹窄具有重要意義。PDGF-BB是從受損血管釋放出的最有效促分裂原之一，在促進(jìn)VSMC增殖中起重要作用［6］。本研究選擇PDGF-BB作為體外刺激劑建立細(xì)胞模型并用JuB進(jìn)行干預(yù)，觀察JuB對(duì)VSMC增殖和遷移能力的影響。

圖4 各組A7r5細(xì)胞LC3B蛋白相對(duì)表達(dá)量

有研究表明JuB具有抗腫瘤作用，然而其是否可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)CCK-8檢測(cè)A7r5細(xì)胞活性間接反應(yīng)細(xì)胞增殖情況，免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到增殖標(biāo)記物PCNA被JuB下調(diào)，并用劃痕愈傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)JuB對(duì)VSMC遷移調(diào)節(jié)作用，首次發(fā)現(xiàn)JuB可能是一種能有效阻止PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移的藥物。

為進(jìn)一步探究JuB對(duì)VSMC增殖和遷移的抑制機(jī)制，本研究檢測(cè)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3蛋白表達(dá)水平。細(xì)胞處于能量匱乏、應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，可通過(guò)上調(diào)自噬分解更多蛋白質(zhì)，從而提供細(xì)胞存活需要的能 量［15］。已有文獻(xiàn) 報(bào) 道，PDGF-BB可誘 導(dǎo) 自 噬［16］。自噬激活可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移［17］。本研究通過(guò)免疫印跡檢測(cè)顯示，JuB可顯著抑制PDGF刺激的A7r5細(xì)胞LC3B蛋白表達(dá)，因此JuB可能通過(guò)抑制自噬發(fā)揮對(duì)VSMC增殖和遷移的抑制作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示JuB可抑制VSMC異常增殖和遷移，機(jī)制上可能與其抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC自噬有關(guān)，提示對(duì)血管介入術(shù)后新內(nèi)膜增生引起的再狹窄具有治療作用。更為具體的生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。