小米分離蛋白提取方法優(yōu)化及對蛋白組成的影響

張 凡，李書田，王顯瑞，沈 群*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 植物蛋白與谷物加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心 北京100083 2 赤峰市農(nóng)牧科學(xué)研究院谷子研究所 內(nèi)蒙古赤峰024031）

小米（foxtail millet），屬禾本科、狗尾草屬的一年生草本植物，原產(chǎn)于我國北方黃河流域，其種植歷史可追溯到8 000年前。小米營養(yǎng)豐富，各種營養(yǎng)素比例適宜，富含膳食纖維、礦物質(zhì)（鈣和鐵）、維生素B 和多酚類物質(zhì)等。此外，小米粗蛋白屬低過敏性蛋白，可供麩質(zhì)過敏人群食用，且小米多肽被證實(shí)具有抗氧化、降血壓、修復(fù)肝損傷以及參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等功能活性[1-3]。小米蛋白質(zhì)含有人體必需的8 種氨基酸，且含量遠(yuǎn)高于大米、玉米、小麥等谷物[4]。小米蛋白質(zhì)是一種良好的植物來源蛋白，可以綜合開發(fā)利用，以緩解蛋白質(zhì)資源短缺問題。

長期以來，高質(zhì)量小米蛋白質(zhì)的提取是一個(gè)難以解決的問題，表現(xiàn)為提取率不高，蛋白質(zhì)含量低[5-6]。小米胚乳中淀粉顆粒和蛋白體的緊密結(jié)合，蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間的二硫鍵，高疏水性蛋白組分（醇溶蛋白）以及單寧等物質(zhì)的存在，均阻礙了小米分離蛋白的提取[7-8]。常見的小米蛋白提取方法有鹽法、堿法和酶法，前兩種方法提取率低，資源消耗大且污染環(huán)境，劇烈的提取條件還可能導(dǎo)致蛋白中生物活性物質(zhì)的降解[9-10]。酶法又可分為碳水化合物類酶和蛋白酶兩種，前者通過水解細(xì)胞壁、纖維素、淀粉等非蛋白組分，使蛋白質(zhì)與之分離，后者直接對小米蛋白進(jìn)行降解及修飾，使之成為可溶的多肽而被提取出來[11]。目前大多數(shù)研究集中在如何提高蛋白提取率，忽視了小米分離蛋白（MPI）中蛋白質(zhì)的含量及組成。通過分析不同酶法條件下MPI 的提取率、蛋白質(zhì)含量、分子質(zhì)量分布及二級結(jié)構(gòu)，篩選適合的工藝并結(jié)合響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化，旨在獲得組成全面、結(jié)構(gòu)信息完整且蛋白質(zhì)含量高的MPI，為其今后的深入研究、開發(fā)與利用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米品種為毛毛谷（粗蛋白含量9.24%），赤峰市農(nóng)牧科學(xué)研究院提供。根據(jù)小米的化學(xué)組成及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，選用5 種酶對其水解，分別是：α-淀粉酶（50 U/mg）、糖化酶（100 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）及普魯蘭酶（≥1 U/mg），均購于上海源葉有限公司；復(fù)合纖維素酶（葡聚糖酶活力700 EGU/g，木聚糖酶活力250 FXU/g），丹麥諾維信有限公司。其它試劑為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

半自動凱氏定氮儀KN520，濟(jì)南阿爾瓦儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀，美國PkinElmer 公司；電泳槽及電泳儀，美國Bio-Rad公司；GE Healthcare 凝膠成像儀，美國通用電氣醫(yī)療公司；水浴恒溫振蕩器，上海龍躍有限公司；冷凍干燥機(jī)FD-1A-50，北京博醫(yī)康有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 篩選酶解方法

1.3.1.1 酶法提取小米分離蛋白 用蒸餾水將小米淘洗3 次，低溫烘干，粉碎機(jī)碾磨成粉，過60 目篩，室溫下按料液比1∶5 添加正己烷脫脂4 h 得小米脫脂粉，備用。按照表1 方法酶解小米脫脂粉。試驗(yàn)中酶解溫度及溶液pH 值始終在最適酶活范圍內(nèi)。雙酶或三酶等量添加。酶解后5 000 min 離心20 min，除2 號試驗(yàn)組離心、取上清外，其余組離心、沉淀，水洗數(shù)次至中性，復(fù)溶，凍干48 h，備用。

表1 不同提取方法下的酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions by different extraction methods

將堿法提取MPI 作為酶解法的對照。準(zhǔn)確稱取定量脫脂小米粉，按料液比1∶7 加蒸餾水，加拌均勻后用0.1 mol/L NaOH 調(diào)至pH 9.5，溫度控制為30 ℃，水浴震蕩1.5 h，5 000 r/min 離心20 min，取上清，調(diào)節(jié)pH 4.0，靜置0.5 h，5 000 r/min 離心20 min，水洗數(shù)次沉淀至中性，復(fù)溶，凍干48 h，備用。

1.3.1.2 蛋白質(zhì)含量測定 采用凱氏定氮法，參照GB5009.5-2016 方法對堿法及酶法提取物進(jìn)行蛋白含量測定[12]。小米蛋白氮轉(zhuǎn)化系數(shù)為5.83。由公式（1）、（2）分別計(jì)算提取率和純化因子。

式中，A——凍干粉的質(zhì)量（g）；C——凍干粉的蛋白質(zhì)含量（%）；B——稱取的脫脂小米粉質(zhì)量（g）；D——脫脂小米粉中蛋白質(zhì)含量（%）。

1.3.1.3 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布測定 參考徐婧婷等[13]的方法對MPI 進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。主要步驟是：確定凝膠濃度→制備電泳膠→處理蛋白樣品→上樣→恒壓下電泳→染色→脫色。使用Quantity One v4.62 對將脫色后的電泳凝膠進(jìn)行分子質(zhì)量分析。

1.3.1.4 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)測定[14]室溫條件下使用傅里葉紅外光譜儀（FTIR）在波數(shù)4 000～400 cm-1范圍對MPI 掃描。以光譜純的溴化鉀壓片作為空白。按照1∶200 的比例加入蛋白樣品和溴化鉀，研磨均勻后壓片。掃描條件：分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)256。使用PeakFit v4 軟件在酰胺Ⅰ帶范圍對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.3.2 酶法提取小米分離蛋白工藝優(yōu)化

1.3.2.1 單因素條件探究 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，為進(jìn)一步得到高蛋白含量的MPI，選擇最優(yōu)酶解方法進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)中考察料液比、小米脫脂粉粉碎目數(shù)、pH 值、酶解溫度、加酶量和酶解時(shí)間對蛋白質(zhì)含量的影響，各水平設(shè)置條件見表2。

1.3.2.2 酶法工藝優(yōu)化 以酶解后所得蛋白質(zhì)含量為考察值，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取pH 值、溫度、加酶量及酶解時(shí)間為試驗(yàn)因素。通過Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表3）進(jìn)行四因素三水平分析。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，使用IBM 公司的SPSS Statistics 25 軟件進(jìn)行方差分析及Duncan 分析，采用Origin Pro 2015 軟件繪圖，Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表2 酶法提取小米分離蛋白響應(yīng)面分析因素和水平Table 2 Factors and levels for response surface analysis of enzymatic extraction of foxtail millet isolate protein

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平編碼表Table 3 The factors and levels of Box-Behnken design

2 結(jié)果與討論

2.1 不同酶解方法的比較與篩選

2.1.1 小米分離蛋白含量 圖1 顯示不同提取方法下MPI 的提取率、蛋白含量及純化因子。純化因子代表在該方法下MPI 被提出的程度，從側(cè)面反映MPI 中的蛋白質(zhì)含量。在提取率一定的前提下，為得到蛋白質(zhì)含量較高的MPI，重點(diǎn)研究蛋白含量。從圖1 可看出，雖然堿溶酸沉條件下MPI 的蛋白質(zhì)含量最高（65.91%），但是此時(shí)MPI 的提取率遠(yuǎn)低于其余5 種酶法，僅5.17%。劉劍利等[5]優(yōu)化堿法提取MPI 的工藝條件后，提取率達(dá)38.79%。楊樺[11]對超聲波輔助酶法提取MPI 的工藝進(jìn)行優(yōu)化，提取率達(dá)（74.26±1.2）%。由此可見堿法條件下MPI 的提取率遠(yuǎn)不如酶法。許多研究認(rèn)為強(qiáng)堿條件下提取蛋白可能伴隨著蛋白質(zhì)的變性、水解，形成有毒物質(zhì)賴丙氨酸，美拉德反應(yīng)加重引起蛋白產(chǎn)物顏色過深等不良反應(yīng)[15]。相比之下，酶法條更為溫和，反應(yīng)針對性強(qiáng)。

圖1 酶解條件對MPI 提取率、蛋白質(zhì)含量及純化因子的影響Fig.1 Effects of different enzymatic hydrolysis conditions on extraction yield，protein content and purification factors of MPI

堿性蛋白酶法所得MPI 蛋白質(zhì)含量較高，為41.8%。然而，堿性蛋白酶條件下會導(dǎo)致所提蛋白質(zhì)部分水解以及結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)改變，因而不予采納[16-17]。就MPI 蛋白質(zhì)含量以及提取率而言，三酶法＞雙酶法＞單酶法。提取率均能達(dá)到47%以上，其中α-淀粉酶/糖化酶/普魯蘭酶法提取率最高，為80.98%；α-淀粉酶/糖化酶/復(fù)合纖維素酶法的MPI蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)44.07%，此時(shí)蛋白純化因子為4.77。

淀粉是小米的主要成分，碳水化合物類酶的加入可將除蛋白外的諸如淀粉等大分子物質(zhì)水解[18]。將鑲嵌在蛋白質(zhì)基質(zhì)中的淀粉粒以及與蛋白體緊密結(jié)合的淀粉顆粒分離開來，所得MPI 的蛋白質(zhì)含量高[19]。α-淀粉酶/糖化酶/復(fù)合纖維素酶在酶解過程中，復(fù)合纖維素酶可破壞細(xì)胞壁成分，有利于淀粉酶的進(jìn)入以及蛋白體的釋放，α-淀粉酶作用于淀粉鏈上的α-1，4-糖苷鍵，水解產(chǎn)生糊精、低聚糖，糖化酶則從非還原末端切開α-1，4-糖苷鍵并緩慢切開α-1，6-糖苷鍵，使淀粉最終水解成小分子的葡萄糖。此時(shí)淀粉被水解，胚乳細(xì)胞中的蛋白被分離，獲得蛋白含量最高的MPI。而在提取方法4（α-淀粉酶/糖化酶/普魯蘭酶）中，普魯蘭酶作為脫支酶的一種，可專一性水解麥芽三糖和以α-1，6 糖苷鍵連接起來的聚合物，與α-淀粉酶/糖化酶聯(lián)合使用可徹底水解淀粉。然而，淀粉顆粒、蛋白體等物質(zhì)均存在于胚乳細(xì)胞中，細(xì)胞壁的存在可能限制了酶與淀粉底物的接觸，因而相同條件下，復(fù)合纖維素酶破除細(xì)胞壁屏障，釋放內(nèi)含物與酶發(fā)生接觸，從而使淀粉水解更為徹底[20-21]。

2.1.2 小米分離蛋白分子質(zhì)量分布 不同提取條件下MPI 分子質(zhì)量分布見圖2 及表4。提取方法不同，MPI 分子質(zhì)量分布情況不同。整體而言，MPI中小分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)居多。小米清、球蛋白譜帶分布廣泛，主要集中在高分子質(zhì)量范圍，其中70，56，35，20 ku 被認(rèn)為是球蛋白的特征譜帶[13，22]，這些條帶在圖2 中均明顯存在。文獻(xiàn)[21]稱不同酶解方法如高溫淀粉酶解、高溫淀粉酶/復(fù)合纖維素酶解（Multifect XL）對大米可溶性蛋白的組分沒有影響。醇溶蛋白約占小米總蛋白的60%，主要包含27～13 ku 亞基，根據(jù)其溶解性不同還可細(xì)分為α醇溶蛋白（18～21 ku）、β 醇溶蛋白（15 ku）以及γ醇溶蛋白（23 ku）[23-24]。此外，谷蛋白作為小米另一貯藏蛋白，蛋白譜帶雖分布廣泛，但也主要集中在低分子質(zhì)量范圍。MPI 電泳圖中相當(dāng)一部分條帶集中在小分子質(zhì)量范圍。

相比于淀粉酶類法，堿性蛋白酶法（泳道2）及堿溶酸沉法（泳道6）得到的小米總蛋白分子質(zhì)量分布相似，小于30 ku 的蛋白條帶分布均低于55%，可能是由于在強(qiáng)堿性條件下提取的蛋白主要為谷蛋白，而此時(shí)疏水性較強(qiáng)的醇溶蛋白未能被完全提取。有報(bào)道稱，堿性條件下提取的高粱分離蛋白僅有5%～15%為醇溶蛋白組分[25]。此外，由表4 可知，堿性條件下MPI 發(fā)生蛋白質(zhì)分子聚集的現(xiàn)象，大于85 ku 的蛋白條帶明顯高于其它試驗(yàn)組。Valenzuela 等[26]認(rèn)為在pH＞10 的堿性條件下，藜麥蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的聚集現(xiàn)象。就碳水化合物類酶而言，雙酶法及三酶法條件下，MPI 分子質(zhì)量分布情況沒有明顯差異，與單淀粉酶法略有不同。

圖2 不同提取方法的MPI 的SDS 電泳圖Fig.2 The SDS-PAGE electrophoresis of MPI extracted by different extraction techniques

表4 不同提取方法的MPI 分子質(zhì)量分布Table 4 Molecular weight distribution as a percentage of MPI extracted by different extraction techniques

2.1.3 小米分離蛋白二級結(jié)構(gòu) 利用FTIR 分析不同提取方法的MPI 的二級結(jié)構(gòu)信息（表5）。FTIR 可通過去卷積、二階求導(dǎo)、曲線擬合等方式獲得蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1）中的信息，分析出蛋白質(zhì)的α 螺旋（1 658～1 650 cm-1）、β折疊（1 640～1 610 cm-1）、β 轉(zhuǎn)角（1 700～1 660 cm-1）、無規(guī)卷曲（1 650～1 640 cm-1）結(jié)構(gòu)[14]。

β 折疊是多肽鏈的一種伸展結(jié)構(gòu)，往往與蛋白質(zhì)的聚集以及天然結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)，而α 螺旋結(jié)構(gòu)往往與蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)存在聯(lián)系[14]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)發(fā)生變性時(shí)，蛋白質(zhì)分子由卷曲態(tài)變?yōu)樯煺箲B(tài)，α 螺旋含量變少，同時(shí)β 折疊及β 轉(zhuǎn)角含量增加，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)指沒有規(guī)則的多肽構(gòu)象[27-28]。

從表6 可知，5 種酶法提取條件對小米二級結(jié)構(gòu)無顯著影響，β 折疊及β 轉(zhuǎn)角是MPI 主要的二級結(jié)構(gòu)。堿法條件下，小米分離蛋白α 螺旋結(jié)構(gòu)值最小，β 折疊結(jié)構(gòu)值最大，說明相比于酶法，堿法提取的MPI 酰胺基間的氫鍵作用力降低，分子間靜電斥力的增加[29]。提取方法不同，α 螺旋/β 折疊比例不同，即具體的提取條件影響蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)信息[30-31]。

表5 不同提取方法的MPI 二級結(jié)構(gòu)（%）Table 5 Proportions of secondary structures of MPI extracted by different extraction techniques（%）

綜上所述，堿溶酸沉法條件劇烈，不利于保持蛋白的天然結(jié)構(gòu)。相比而言酶法條件更為溫和，然而同樣因強(qiáng)堿環(huán)境下不利于除谷蛋白外其余蛋白組分的提取。α-淀粉酶/糖化酶/復(fù)合纖維素酶法（提取方法4）所得MPI 提取率、蛋白含量高，且較大程度地保留了小米蛋白的結(jié)構(gòu)信息，因此對α-淀粉酶/糖化酶/復(fù)合纖維素酶法進(jìn)行后續(xù)條件的優(yōu)化，以期獲得蛋白含量更高的MPI。

2.2 酶法提取小米分離蛋白單因素條件

為了提高M(jìn)PI 的蛋白質(zhì)含量，選取料液比1∶7，粉碎目數(shù)60，pH 5.0，酶解溫度50 ℃，加酶量2%，酶解時(shí)間12 h 條件，改變其中1 個(gè)因素，保持其它參數(shù)不變，分析各因素指標(biāo)變化對蛋白質(zhì)提取率的影響，結(jié)果見圖3。

1）由圖3a 可知，當(dāng)料液比1∶7 時(shí)，MPI 的蛋白質(zhì)含量最高，（58.27±0.69）%。當(dāng)料液比再增加時(shí)，MPI 的蛋白質(zhì)含量反而下降。這可能是由于料液比較大時(shí)，存在的濃度差促使傳質(zhì)推動力增大，也就是說更多非蛋白可溶性物質(zhì)溶出，從而影響MPI 蛋白質(zhì)含量[32]。最終選擇料液比1∶7 為最佳的料液比，做后續(xù)試驗(yàn)。

2）由圖3b 可知，粉碎目數(shù)為80 目時(shí)，MPI的蛋白質(zhì)含量最高。同樣，當(dāng)粉碎目數(shù)增加，小米內(nèi)非蛋白可溶性物質(zhì)與溶劑的接觸面增加，這導(dǎo)致MPI 蛋白質(zhì)含量下降。最佳粉碎目數(shù)為80 目。

3）考慮到α-淀粉酶、糖化酶及復(fù)合纖維素酶的最適pH 值略有不同，有必要對蛋白提取環(huán)境的pH 值進(jìn)行優(yōu)化。由圖3c 可知，當(dāng)溶液pH 值由4.0 升至4.5 時(shí)，蛋白質(zhì)含量顯著提高，而后隨著pH 值的增加而緩慢下降。溶液pH 值與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的關(guān)系決定了蛋白質(zhì)表面電荷的分布情況以及與蛋白水分子間的相互作用力[33]。已知小米蛋白的等電點(diǎn)4.0 左右，此時(shí)MPI 蛋白質(zhì)含量不僅與不同pH 值下3 種酶的酶活有關(guān)，也與MPI 的溶解性有關(guān)。反應(yīng)最適pH 4.5。

4）由圖3d 可知，當(dāng)溫度50 ℃時(shí)，MPI 蛋白質(zhì)含量到達(dá)最大值（62.84±0.49）%；當(dāng)溫度低于或高于50 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)含量均下降。同樣的，復(fù)合酶體系溫度的確定十分重要，要保證該溫度下3 種酶均有相當(dāng)強(qiáng)的活性，溫度過高或過低均影響酶促反應(yīng)的進(jìn)行。在單因素優(yōu)化試驗(yàn)中，保持蛋白提取在50 ℃環(huán)境條件下進(jìn)行。

5）由圖3e 可知，加酶量在0.5%～2.0%時(shí)，蛋白質(zhì)含量隨酶量的增加而增加，當(dāng)加酶量2.0%時(shí)可獲得蛋白質(zhì)含量最高的MPI。加酶量繼續(xù)增加（＞2.0%），MPI 中蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢。當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中的酶少量存在時(shí)，體系處于酶反應(yīng)動力學(xué)的初級階段，所有的酶全部參與到反應(yīng)中，2%的加酶量即達(dá)到飽和狀態(tài)[11]。由于反應(yīng)體系中底物量（小米脫脂粉）是一定的，加酶量繼續(xù)增加并不會促進(jìn)酶促反應(yīng)的進(jìn)行。最優(yōu)加酶量設(shè)定為2%。

6）由圖3f 可知，添加復(fù)合酶的0～12 h 內(nèi)，MPI 的蛋白含量顯著升高，酶解12 h 獲得最高蛋白含量的MPI，（66.65±1.02）%。當(dāng)酶解時(shí)間超過12 h 時(shí)，時(shí)間不再成為影響蛋白含量的主要因素。最終選擇酶解時(shí)間為12 h。

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design-expert 8.0 軟件對表6 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到MPI 蛋白質(zhì)含量Y 對4個(gè)自變量X1、X2、X3、X4的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=66.24 +14.48X1-2.59X2+11.37X3+3.07X4+0.21 X1X2+5.15X1X3-0.32X1X4-4.14X2X3-2.64X2X4-0.21 X3X4-17.32X12-10.93X22-14.08X32-7.25X42。響應(yīng)面分析試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表7。

圖3 不同因素對小米分離蛋白蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of different factors on the protein content of millet protein isolate

表6 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Program and experimental results of Box-Behnken test

表7 回歸模型方差及可信度分析Table 7 Analysis of variance and reliability of regression model

由表7 可看出，回歸模型P＜0.0001，此二次回歸方程模型差異極顯著，模型的相關(guān)方程能夠正確反應(yīng)酶法提取MPI 蛋白含量與各因素之間的關(guān)系。失擬項(xiàng)P=0.0813＞0.05，表示其不顯著，試驗(yàn)誤差小，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9872，R2Adj=0.9744，說明回歸模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，不存在其它未考慮的影響因素?？衫么嘶貧w方程對MPI 蛋白含量進(jìn)行分析、預(yù)測。

由表7 可知，X1，X2，X3，X4，X12，X22，X32，X42顯著影響小米總蛋白含量，說明選取的4 個(gè)因素對小米分離蛋白蛋白含量的影響成非簡單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)同樣對響應(yīng)值影響顯著。此外X1X3，X2X3，兩兩交互項(xiàng)對響應(yīng)值也影響顯著（圖4）。響應(yīng)面的陡峭程度隨pH 值、加酶量的變化起伏較大，說明pH 值、加酶量對蛋白含量的影響大于反應(yīng)溫度和時(shí)間，該分析與表7 中方差分析結(jié)論一致。

為進(jìn)一步確定三酶法提取高蛋白含量MPI 的最佳工藝，運(yùn)用Design Expert 8.0.6 分析回歸方程，得到最佳工藝條件為：pH 4.7，酶解溫度48℃，加酶量2.2%，酶解時(shí)間10 h，此條件下預(yù)期的蛋白質(zhì)含量69.11%，實(shí)際測得MPI 蛋白含量為（69.49±0.23）%，與預(yù)測值接近，偏差小，說明回歸模型具有準(zhǔn)確性和實(shí)用性。在該最佳條件下，對酶解后產(chǎn)物進(jìn)行透析處理，將酶解后淀粉水解產(chǎn)生的小分子雜質(zhì)除去，大分子蛋白截留在透析袋中，隨后對透析后的MPI 進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定，可得蛋白質(zhì)含量為（73.56±0.18）%。該方法較其它MPI提取方法有明顯優(yōu)勢[5，11，34-35]。

3 結(jié)論

相比于堿溶酸沉法，酶法特異性強(qiáng)，條件相對溫和，對蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)影響小，且蛋白提取率顯著高于堿法。通過分析單酶法、雙酶法及三酶法條件下的MPI 的分子質(zhì)量分布、二級結(jié)構(gòu)、提取率以及蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶/糖化酶/復(fù)合纖維素酶法能較完整地提取小米蛋白的信息，此時(shí)蛋白質(zhì)含量最高。

圖4 各交互作用對MPI 蛋白含量影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots of the interaction of various factors on the MPI protein content

通過回歸分析確定α-淀粉酶/糖化酶/復(fù)合纖維素酶法提取高蛋白含量MPI 的最佳pH 4.7，酶解溫度48 ℃，加酶量2.2%，酶解時(shí)間10 h。該處理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)含量達(dá)（69.49±0.23）%，較其它MPI 提取方法優(yōu)勢明顯。