低溫脅迫下梁山慈竹體細(xì)胞突變體植株葉綠素?zé)晒忭憫?yīng)

張麗, 陳洪, 王準(zhǔn), 龍治堅(jiān), 孫鵬, 胡尚連*

1. 四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081；

2. 瀘州市林業(yè)科學(xué)研究院，四川 瀘州 646000；

3. 西南科技大學(xué)，四川 綿陽 621010

植物光合作用對低溫脅迫非常敏感，低溫脅迫可引起光合效率的降低，從而影響植物的生長、產(chǎn)量和抗性[1]。葉綠素?zé)晒饩哂醒杆?、靈敏、定量測定、無破壞、少干擾的特點(diǎn)，是光合作用能量轉(zhuǎn)換的探針[2]，能真實(shí)反映植物葉片光合效應(yīng)及環(huán)境因子對光合作用的影響和熱耗散情況，是判斷植物生長狀況和抗逆性強(qiáng)弱的重要方法[3-5]。通過監(jiān)測對光抑制反應(yīng)較明顯的葉綠體熒光參數(shù)最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、光系統(tǒng)Ⅱ有效光量子產(chǎn)量（YⅡ）、非光化學(xué)猝滅系數(shù)（NPQ）和光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）的變化，有助于分析光合機(jī)構(gòu)受低溫影響的程度。

梁山慈竹(Dendrocalamus farinosus)是我國西南地區(qū)的主要叢生竹種，纖維質(zhì)量較高，是優(yōu)良的造紙?jiān)?。但該竹種耐寒性不強(qiáng)，春冬季低溫影響其產(chǎn)量和分布，創(chuàng)制并選育耐寒品系是提高漿用竹林資源存量與增量的科技途徑之一。離體和化學(xué)誘變獲得的體細(xì)胞突變體是改良物種，拓寬其遺傳資源的有效技術(shù)手段[6]。胡尚連等[7]以梁山慈竹種子成熟胚為材料，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)與突變體系的建立，通過離體和化學(xué)誘變獲得了一批梁山慈竹體細(xì)胞突變體植株。在該成果的基礎(chǔ)上，本研究以冷馴化的2種梁山慈竹突變體植株和對照實(shí)生植株為材料，研究其在短期系列低溫脅迫后的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化，以期為耐寒梁山慈竹新品系的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及預(yù)處理

梁山慈竹體細(xì)胞突變體植株No.101-1b和No.101-1c為2009年8月對梁山慈竹成熟胚離體誘導(dǎo)愈傷組織，再經(jīng)過化學(xué)誘變獲得[7]，同期生長的梁山慈竹實(shí)生植株（CK）由西南科技大學(xué)生命科院植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室提供。No.101-1b和No.101-1c植株和實(shí)生植株擴(kuò)繁的后代于2012年4月移栽西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院資源圃。取自然環(huán)境下長勢良好且一致的1年生No.101-1b、No.101-1c和CK植株在直徑30 cm、高35 cm的陶瓷盆中培育。在低溫脅迫處理前，將各品系植株在11月室外（晝夜平均溫度為15 ℃/8 ℃）的自然條件下冷馴化26 d。

1.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

先將各植株在室溫15 ℃暗環(huán)境下放置20 min，保持黑暗條件，用Imaging-PAM調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上駜x（德國Walz公司）測定頂端起第一枝條、枝稍起第3片完全展開成熟葉的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、YⅡ、NPQ、qP，再將植株置于遮光的GDW型高低溫試驗(yàn)箱（升降溫速率 0.70 ℃·min?1～1.00 ℃·min?1）內(nèi)，設(shè)置 4 ℃、0 ℃、?5 ℃、?10 ℃、?15 ℃ 等溫度梯度，在每一溫度各處理90 min后于暗環(huán)境下依次測量上述4項(xiàng)葉綠素?zé)晒鈪?shù)直至植株失去生命體征（表現(xiàn)為NPQ及qP趨近為0），以CK為對照。每組 3 次重復(fù)，測量光強(qiáng)度 PAR 為 81·μmol·m?2·s?1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件（SPSS Inc., USA）對葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行兩因素方差分析，分別檢驗(yàn)溫度、品系主效應(yīng)和兩者間交互效應(yīng)。對同一品系不同溫度、同一溫度不同品系的葉綠素?zé)晒鈪?shù)分別進(jìn)行單因子方差分析（One-way ANOVA），最小顯著差數(shù)法（LSD法）進(jìn)行多重比較。顯著水平α定為0.05。Excel 2007制表并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理對梁山慈竹體細(xì)胞突變體植株存活的影響

在系列低溫脅迫下，2個體細(xì)胞突變體植株的存活情況不盡相同。表1顯示，對照CK在?5 ℃脅迫下死亡（脅迫后NPQ及qP趨近為0），而突變體No.101-1b和No.101-1c在-15 ℃脅迫下死亡。

2.2 低溫處理對梁山慈竹體細(xì)胞突變體植株Fv/Fm的影響

植物可變熒光Fv與最大熒光Fm的比值Fv/Fm能夠良好地反映光合色素把捕獲的光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的速度和效率[8]。當(dāng)植物處于逆境或受傷害時Fv/Fm值會明顯降低，意味著光合作用受到抑制[9-10]。由圖1可以看出，15/8 ℃時對照CK和突變體No.101-1b的Fv/Fm值差異不顯著，突變體No.101-1c的Fv/Fm值比前兩者更低，差異顯著。但CK的Fv/Fm值在4 ℃和0 ℃下相對于15/8 ℃劇烈下降，平均降幅達(dá)33.54%，且經(jīng)-5 ℃低溫脅迫后死亡。No.101-1b的平均下降幅度比CK小，為19.53%，且經(jīng)過4 ℃、0 ℃、-5 ℃、-10 ℃ 4個梯度脅迫，直到?15 ℃脅迫后死亡。No.101-1c經(jīng)5個梯度低溫脅迫后也出現(xiàn)死亡，但平均降幅僅為4.03%，且在4 ℃時Fv/Fm值降低后，從0 ℃起出現(xiàn)回升趨勢，表現(xiàn)出較好的耐寒性。

表 1 梁山慈竹實(shí)生植株和體細(xì)胞突變體植株在不同低溫脅迫下的存活情況Tab. 1 Survival of seedling plants and somatic mutant plants of Dendrocalamus farinosus under low temperature stress

雙因子方差分析結(jié)果表明，品系和溫度都對Fv/Fm值有極顯著影響，且因溫度降低而變化的Fv/Fm值在不同品系間有極顯著差異（P值均小于0.01）。

2.3 低溫處理 對 梁山慈竹體細(xì)胞突變體植 株YⅡ的影響

YⅡ值代表光系統(tǒng)Ⅱ的實(shí)際量子產(chǎn)量，它反映了植物的實(shí)際光合效率。低溫脅迫下YⅡ值降低越緩慢的植株碳源積累的效率越高，將光抑制降到最低的能力越強(qiáng)[11]。由圖2可知，15/8 ℃時對照CK、突變體No.101-1b和突變體No.101-1c的YⅡ值有顯著差異，No.101-1c>No.101-1b>CK。4 ℃起 CK的YⅡ值經(jīng)低溫脅迫后迅速下降（-5 ℃及以下的低溫已造成植株全部死亡而無數(shù)據(jù)），平均降幅達(dá)67.46%。No.101-1b的YⅡ值隨溫度降低也明顯下降，但整體上比CK下降平緩，平均降幅46.35%。No.101-1c的YⅡ值平均降幅23.17%，且0 ℃～-5 ℃范圍內(nèi)的YⅡ值相對于4 ℃時升高，直到-10 ℃下回落，說明其具有較高的碳源積累效率，更有利于維持光合能力。

圖 1 梁山慈竹實(shí)生植株和體細(xì)胞突變體植株在不同低溫脅迫下Fv/Fm的變化Fig. 1 Changes of Fv/Fm values in Dendrocalamus farinosus seedling plants and somatic mutant plants under different low temperature stress

圖 2 梁山慈竹實(shí)生植株和體細(xì)胞突變體植株在不同低溫脅迫下YⅡ的變化Fig. 2 Changes of YⅡ values in Dendrocalamus farinosus seedling plants and somatic mutant plants under different low temperature stress

雙因子方差分析結(jié)果表明，品系和溫度都對YⅡ值有極顯著影響，且因溫度降低而變化的YⅡ值在不同品系間有極顯著差異（P值均小于0.01）。

2.4 低溫處理 對 梁山慈竹體細(xì)胞突變體植 株NPQ的影響

NPQ是包括熱耗散及其他能量耗散過程在內(nèi)的非光化學(xué)猝滅系數(shù)，它反映了植物耗散過剩光能的能力，暗示植物已啟動了光保護(hù)反應(yīng)以避免過量光傷害[12]。從圖3可以看出，15/8 ℃時對照CK、突變體No.101-1b和突變體No.101-1c的NPQ值有顯著差異，CK>No.101-1c>No.101-1b。4 ℃時，CK、No.101-1b和No.101-1c的NPQ值均顯著升高，分別升高52.67%、109.43%、89.27%，0 ℃時 CK相對于 15/8 ℃無明顯變化，而突變體 No.101-1b和No.101-1c仍保持上升規(guī)律，分別比15/8 ℃升高99.62%和95.16%，這說明CK在低溫脅迫下保護(hù)自身的能力較低，No.101-1b和No.101-1c較高。

圖 3 梁山慈竹實(shí)生植株和體細(xì)胞突變體植株在不同低溫脅迫下NPQ的變化Fig. 3 Changes of NPQ values in Dendrocalamus farinosus seedling plants and somatic mutant plants under different low temperature stress

雙因子方差分析及交互檢驗(yàn)結(jié)果表明，品系和溫度都對NPQ值有極顯著影響，且因溫度降低而變化的NPQ值在不同品系間有極顯著差異（P值均小于 0.01）。

2.5 低溫處理 對 梁山慈竹體細(xì)胞突變體植 株qP的影響

由光合作用引起的熒光淬滅稱為光化學(xué)淬滅qP，它反映了植物光合活性的大小。高qP值可以加速推動光合電子傳遞能力，促進(jìn)光合效率增長[13]。由圖4可知，15/8 ℃時對照CK、突變體No.101-1b和突變體No.101-1c的qP值有顯著差異，No.101-1c> CK > No.101-1b。之后，梁山慈竹各品系植株在低溫脅迫后的qP值均下降，顯著低于15/8 ℃。4 ℃下qP降幅排序?yàn)镹o.101-1c> CK> No.101-1b（分別為35.93%、20.97%、10.77%），而0 ℃時各品系植株的qP值與15/8 ℃時相比，CK降幅最大（66.93%），突變體No.101-1b和No.101-1c降幅依次減?。ǚ謩e為 58.61%、42.91%）。?5 ℃ 和?10 ℃ 下，No.101-1b相對 15/8 ℃的qP值降幅一直大于 No.101-1c。qP平均值方面，如果已死亡植株的qP值按0計(jì)，那么經(jīng)低溫脅迫后No.101-1c的qP平均值最高，No.101-1b居中，CK最小。

圖 4 梁山慈竹實(shí)生植株和體細(xì)胞突變體植株在不同低溫脅迫下qP的變化Fig. 4 Changes of qP values in Dendrocalamus farinosus seedling plants and somatic mutant plants under different low temperature stress

雙因子方差分析及交互檢驗(yàn)結(jié)果表明，品系和溫度都對qP值有極顯著影響，且因溫度降低而變化的qP值在不同品系間有極顯著差異（P值均小于0.01）。

3 討論

低溫會抑制光系統(tǒng)Ⅱ的活性，使其光能捕捉能力與光化學(xué)轉(zhuǎn)化效率降低、熱耗散比例增高、反應(yīng)中心的開放率下降，甚至對光合結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不可逆的破壞，從而使葉綠素?zé)晒鈪?shù)發(fā)生變化[14-15]。本研究中2個體細(xì)胞突變體植株的Fv/Fm、YⅡ和qP的值大多隨著低溫脅迫的加劇而降低，也說明植物光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心開放率受到影響，實(shí)際光合效率和光合活性均受到明顯抑制[16-18]。NPQ的值隨著低溫脅迫的加劇而增大，說明植物通過熱耗散消耗多余熱量來抵御過剩光能傷害，使光合作用能量達(dá)到新的平衡來適應(yīng)脅迫環(huán)境[15][18]。對比突變體植株No.101-1b和實(shí)生植株CK，突變體植株No.101-1c的各項(xiàng)葉綠素?zé)晒鈪?shù)都表現(xiàn)出較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性和耐寒性，表明葉綠素?zé)晒鈪?shù)可作為低溫脅迫時竹類植物受傷情況和抗凍能力的鑒定指標(biāo)[19]，也是遺傳育種篩選耐寒品系的有效手段。

經(jīng)歷春冬季低溫后，氣溫逐漸回暖，部分耐寒植物能重新恢復(fù)生機(jī)，所以研究解除低溫脅迫后植物葉綠素?zé)晒鈪?shù)的響應(yīng)同樣是篩選耐寒植物方法之一。溫度逐步恢復(fù)后，部分光合功能失活的竹類植物可呈現(xiàn)兩種狀態(tài)：一種發(fā)生可逆失活，光抑制迅速恢復(fù)，這可能是反應(yīng)中心部分失活所致。一種發(fā)生不可逆失活，完全沒有恢復(fù)跡象，表明低溫脅迫嚴(yán)重破壞了反應(yīng)中心[20-21]。此外，高溫脅迫會破壞竹類植物的光系統(tǒng)，表現(xiàn)為光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的失活、Fv/Fm降低、捕光葉綠素ab蛋白復(fù)合物降解等[22]。由此，低溫脅迫后的梁山慈竹體細(xì)胞突變植株的恢復(fù)，以及高溫脅迫對體細(xì)胞突變植株生存適應(yīng)影響等方面，有待進(jìn)一步研究。

近年來，我國已成為世界上竹漿產(chǎn)量和使用量最大的國家，竹漿也成為我國竹產(chǎn)業(yè)新的重要經(jīng)濟(jì)生長點(diǎn)，對我國生態(tài)保護(hù)、鄉(xiāng)村振興、農(nóng)民增收、產(chǎn)業(yè)安全保障都具有深刻的影響[23]。本研究已初篩出梁山慈竹體細(xì)胞突變體植株No.101-1c具有較強(qiáng)的耐寒性能，但其在纖維素含量、木質(zhì)素含量、纖維形態(tài)、適地引種、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)等方面還需要進(jìn)一步探索，以期為西南地區(qū)漿用竹原料基地的優(yōu)存量、促增量建設(shè)提供竹種選用的科學(xué)依據(jù)。