李文俊, 姜麗瓊, 劉瓊, 肖前剛, 浣杰, 徐志萍, 楊洪燕
成都市農(nóng)林科學(xué)院,四川 成都 611130
白及[Bletilla striata(Thunb.) H.G.Reichenbach]是蘭科白及屬的多年生草本植物[1],主要分布在云南、四川和貴州等地[2],白及具有廣泛的藥用價(jià)值及園林價(jià)值,白及以根莖入藥,具有收斂止血、消腫生肌等功效,是我國(guó)重要的中藥材[3],亦可作為盆栽室內(nèi)觀賞,點(diǎn)綴于較為蔭蔽的花臺(tái)、花境或庭院一角[4]。此外,白及亦是裝裱書(shū)畫(huà)的高品質(zhì)粘合劑,并廣泛應(yīng)用于高檔美容化妝品及保健等行業(yè)[5]。
白及屬植物種間和種內(nèi)遺傳分化強(qiáng)烈[6],本研究在白及資源調(diào)查和收集過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)白及表型變異程度較大,主要表現(xiàn)在株型、花型、花色、花期、花量、花莖、葉片形態(tài)、托葉宿存情況及托葉大小及抗逆性等方面,花色有白色、淡粉色、粉紫色、紫色、深紫色等,開(kāi)花時(shí)間主要在3—5月之間變化,葉片形態(tài)存在寬窄差異,從表型看,白及種內(nèi)差異較大。
nrDNA ITS序列是位于真核生物nrDNA18S和26S之間的內(nèi)含子[7],由于進(jìn)化中的選擇壓力小,nrDNA ITS片段在物種水平的變異較快,有更多的突變位點(diǎn)以區(qū)分不同的物種,常用于物種鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究[8]。而在蘭科植物中,Kurt[9]等指出蘭科植物的ycf1(Hypothetical chloroplast openreading frame 1)基因具有高度變異性,并比matK基因更具有可靠的變異信息位點(diǎn)。本研究收集來(lái)源于四川和云南的30個(gè)白及單株,克隆并分析其nrDNA ITS序列和葉綠體ycf1序列的差異基因,以期為白及遺傳分化研究鑒定提供理論基礎(chǔ)。
在四川和云南采集白及野生種和栽培種共30個(gè)樣本,樣本植株移栽在成都市農(nóng)林科學(xué)院科研基地,試驗(yàn)時(shí)選擇成熟個(gè)體,取無(wú)病蟲(chóng)害的葉片立即放在液氮中,-80 ℃保存待用(見(jiàn)表1)。
采用植物DNA提取試劑盒(TIANGEN公司)提取DNA,并參考吳勁松[10]文獻(xiàn)中ITS、ycf1基因引物及相關(guān)體系進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增、電泳檢測(cè)、切膠回收、測(cè)序(見(jiàn)表2)。
表 1 供試材料表Tab. 1 Basic information of the tested materials
表 2 引物序列Tab. 2 Primer sequences
利用DNAstar軟件分析ITS和ycf1序列的長(zhǎng)度和G+C含量;運(yùn)用DNAMAN 工具對(duì)ITS和ycf1序列進(jìn)行多序列比對(duì),分析序列的同源性,采用鄰位連接法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),選擇檢驗(yàn)方法為“Bootstrap method”,重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000,應(yīng)用軟件MEGA7.0[11](Molecular evolution genetics analysis)分子進(jìn)化遺傳分析軟件分析系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。
對(duì)30個(gè)白及樣本的nrDNA ITS和葉綠體ycf1序列進(jìn)行擴(kuò)增,如表3所示,獲得ITS序列長(zhǎng)度為633?742 bp,GC含量為 59.97%~61.64%,ycf1序列長(zhǎng)度為864~969 bp,GC含量為27.76%~28.47%。
表 3 序列長(zhǎng)度及 GC 含量Tab. 3 Sequence length and GC content
通過(guò)比對(duì),確定本研究涉及材料nrDNA ITS序列和葉綠體ycf1序列存在不同程度的變異,根據(jù)ycf1基因共鑒定出5個(gè)單倍型,存在4個(gè)變異位點(diǎn),B_4和B_5屬于B型,B_11屬于C型,B_12屬于D型,B_16屬于E型,其余25個(gè)樣本屬于A型,具體變異情況見(jiàn)表4。
相比較葉綠體ycf1基因,nrDNA ITS基因變異程度較大,共鑒定出11個(gè)單倍型,存在32個(gè)變異位點(diǎn),其中 B_1、B_2、B_3、B_6、B_15、B_23屬于 A型 , B_4、 B_5、 B_14屬 于 B型 , B_7、B_16、B_17、B_18、B_25、B_26、B_27、B_28 屬于 C型,B_8、B_9、B_10屬于 D型,B_19、B_20、 B_21、 B_29屬 于 E 型 , B_11、 B_12、B_13、B_22、B_24、B_30分別屬于 F、G、H、I、J、K型,具體變異情況見(jiàn)表5。
表 4 葉綠體 ycf1基因變異情況Tab. 4 Variation of ycf1 genes in chloroplasts
表 5 nrDNA ITS 基因變異情況Tab. 5 Variation of nrDNA ITS genes
本研究中,共得到白及30條ITS序列,共鑒定出11個(gè)單倍型,表現(xiàn)出很高的雜合性,構(gòu)建NJ樹(shù),發(fā)現(xiàn)30份白及材料分為3個(gè)支系,A型、B型、E型聚為一支,B_8和F、G、H、I、J、K型聚為一支,C型和D型聚為一支(見(jiàn)圖1)。
圖 1 基于 ITS 序列的白及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic tree of Bletilla striata based on ITS sequence
白及屬植物具有較高的遺傳多樣性。孫宇龍[12]等通過(guò)SRAP分子標(biāo)記探討了12個(gè)白及野生居群的遺傳多樣性和居群遺傳結(jié)構(gòu),表明白及物種有著豐富的遺傳多樣性,認(rèn)為白及居群間存在中等水平的遺傳分化。周天華[13]等構(gòu)建白及SSR指紋圖譜,認(rèn)為白及屬在種間水平均有較高的遺傳多樣性,物種間遺傳分化強(qiáng)烈,物種間的基因流較弱。
本研究比較30個(gè)白及樣本的ITS序列和ycf1序列,發(fā)現(xiàn)ycf1序列變異較小,ITS序列變異較大,種內(nèi)遺傳多樣性豐富。相比較A型,B_12、B_13、B_13和B_22的ITS序列變異較大,分別發(fā)生了20、22、24和21個(gè)基因位點(diǎn)變異,此四個(gè)樣本變異情況相似,且在表觀上均表現(xiàn)出葉型狹長(zhǎng)、花期晚的性狀,根據(jù)ITS序列差異,將30份白及材料聚類(lèi)為3個(gè)支系,結(jié)合白及的表觀性狀,發(fā)現(xiàn)白及ITS序列與其花期和葉型有相關(guān)性,與花型、花色等其他性狀無(wú)明顯相關(guān)。
種質(zhì)資源是中藥材遺傳育種和品種選育的基礎(chǔ),目前,市場(chǎng)上流通的白及藥材種質(zhì)來(lái)源廣泛,質(zhì)量參差不齊。種源不清、種子種苗質(zhì)量參差不齊,是影響白及規(guī)范化種植和白及藥材質(zhì)量的重要因素[14]。本研究收集白及種質(zhì)資源,克隆并分析白及nrDNA ITS和葉綠體ycf1序列,為白及種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)將對(duì)這批白及種質(zhì)資源的化學(xué)成分、抗逆性和其他品質(zhì)性狀進(jìn)行深入研究,以期為選育產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)、品質(zhì)優(yōu)的新品種提供材料基礎(chǔ)。