圓齒野鴉椿籽油提取工藝及脂肪酸組分分析

陳淑琴，葉燕燕，全穎萱，李林海，倪 林,*，鄒雙全

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 植物保護學(xué)院，福建 福州 350002；2.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002)

圓齒野鴉椿(EuscaphiskonishiiHayata)是省沽油科野鴉椿屬植物[1]，為我國珍貴的觀賞兼藥用樹種，其果皮、枝條、葉片和種子的醇提物均具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用[2-3]。近年來，圓齒野鴉椿人工種植面積不斷擴大，僅福建地區(qū)種植面積就達300公頃以上，植物資源豐富[4]。但針對圓齒野鴉椿籽的研究較少，成分方面的研究多集中于三萜類、酚酸類化合物[5-7]，而含量豐富的油脂類成分卻未見報道。本課題組一直致力于圓齒野鴉椿籽的植物資源開發(fā)與利用[8-11]，研究前期發(fā)現(xiàn)種子的含油率在5%以上，且油中含有的人體必需不飽和脂肪酸含量較高，有較好的開發(fā)前景。響應(yīng)面法是一種通過對響應(yīng)曲面以及等高線的分析來優(yōu)化反應(yīng)條件和最佳加工工藝參數(shù)的方法，采用多元二次回歸方程對響應(yīng)值與多因素試驗的因素進行函數(shù)關(guān)系擬合，對不同參數(shù)進行評價以減少試驗次數(shù)[12-14]。為了進一步明確圓齒野鴉椿籽的含油量及脂肪酸組成，本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化正己烷回流提取圓齒野鴉椿籽油的提取工藝，并分析油中脂肪酸組成，以期為圓齒野鴉椿籽油的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

樣品采自福建省三明市尤溪縣洋中鎮(zhèn)人工培育的4～5年生的圓齒野鴉椿成熟種子；福建農(nóng)林大學(xué)鄒雙全教授鑒定為省沽油科野鴉椿屬圓齒野鴉椿(EuscaphiskonishiiHayata)，采摘時間為2018年11月，留樣保存于福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院制藥工程系。試劑正己烷、乙醚、石油醚、鹽酸、氫氧化鈉、甲醇均為分析純。安捷倫7890A氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；CD-2560毛細管色譜柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)。

1.2 圓齒野鴉椿籽油脂的回流提取

將圓齒野鴉椿籽烘干至質(zhì)量恒定，粉碎后取粒徑0.075 mm部分備用，精密稱取5 g的樣品粉末置于250 mL圓底燒瓶中，加入一定體積的正己烷，置于一定溫度下的恒溫水浴鍋中回流一定時間，提取液趁熱抽濾，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到油脂，稱定其質(zhì)量，并按下式計算油脂提取得率:

1.3 單因素試驗

1.3.1提取時間的影響 固定正己烷-樣品粉末比例(液料比)10 ∶1(mL ∶g，下同)，提取溫度為70 ℃，提取時間分別為30、45、60、75和90 min，按1.2節(jié)方法進行試驗。

1.3.2提取溫度的影響 固定液料比10 ∶1，提取時間為60 min，提取溫度分別為50、60、70、80、90和100 ℃，按1.2節(jié)方法進行試驗。

1.3.3液料比的影響 固定提取時間為60 min，提取溫度為80 ℃，液料比分別為6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1、14 ∶1、16 ∶1，按1.2節(jié)方法進行試驗。

1.4 響應(yīng)面試驗

通過單因素試驗得出提取時間(X1)、提取溫度(X2)和液料比(X3)3個因素的水平值，以提取得率為響應(yīng)值，運用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計及數(shù)據(jù)分析，共設(shè)計17個試驗，其中心點重復(fù)試驗5次。

通過響應(yīng)面分析得到回流提取圓齒野鴉椿籽油的最佳工藝條件，并按照最佳工藝條件重復(fù)試驗3次，以驗證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性。

1.5 圓齒野鴉椿籽不同部位油脂得率及成分分析

1.5.1油脂提取得率 稱取50 g圓齒野鴉椿籽，用刀片分離種皮與種仁，按照1.2節(jié)方法分別對樣品進行油脂回流提取后進行驗證性實驗，得出圓齒野鴉椿種皮與種仁的油脂提取得率。

1.5.2油脂成分

1.5.2.1前處理方法 稱取優(yōu)化條件下提取的圓齒野鴉椿籽油、種仁油和種皮油各約0.1 g，加入100 mg焦性沒食子酸，加入幾粒沸石，再加入2 mL 95%乙醇，混勻。加入12 mol/L鹽酸溶液10 mL，混勻；將燒瓶放入70～80 ℃水浴中水解40 min。每隔10 min振蕩一下燒瓶,使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中；水解完成后，取出燒瓶冷卻至室溫。向水解后的試樣中加入10 mL 95%乙醇,混勻；將水解液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中,用50 mL乙醚石油醚混合液(體積比1 ∶1)沖洗燒瓶和塞子,沖洗液并入分液漏斗中,加蓋，振搖5 min，靜置10 min；將醚層提取液收集到250 mL燒瓶中，按照以上步驟重復(fù)萃取水解液3次,最后用乙醚石油醚混合液沖洗分液漏斗,并收集到已質(zhì)量恒定的燒瓶中，將燒瓶置水浴上蒸干，置烘箱中干燥2 h。干燥的提取物繼續(xù)加入2 mL 2%氫氧化鈉甲醇溶液，85 ℃水浴鍋中水浴30 min，加入3 mL 14%三氟化硼甲醇溶液，繼續(xù)水浴30 min；然后降到室溫，在離心管中加入1 mL正己烷，振蕩萃取2 min之后，靜置1 h，等待分層；取上層清液100 μL，用正己烷定容到1 mL；用0.45 μm濾膜過濾后采用氣相色譜測試。

1.5.2.2色譜條件 升溫程序：130 ℃保持5 min，以4 ℃/min 的速率升溫至240 ℃，保持30 min。色譜柱CD-2560(100 m×0.25 mm×0.20μm)；進樣口溫度250 ℃；載氣流速0.5 mL/min；分流進樣，分流比10 ∶1；檢測器FID；檢測器溫度250 ℃。

1.5.2.3計算公式 試樣中各脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)按公式計算：

式中：W—試樣中各脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)，%；C—試樣測定液中脂肪酸甲酯的質(zhì)量濃度，mg/L；V—體積，mL；k—各脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)化為脂肪酸的換算系數(shù)；N—稀釋倍數(shù)；m—試樣的稱樣質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1提取時間對提取得率的影響 由圖1(a)可知，隨著提取時間的延長，籽油的提取得率先呈上升趨勢，在60 min時達到峰值(提取得率5.57%)，繼續(xù)延長提取時間，部分正乙烷在提取前揮發(fā)，提取得率下降，時間越長，溶劑揮發(fā)越多，提取得率越低。故選取60 min為最優(yōu)回流提取時間。

2.1.2提取溫度對提取得率的影響 由圖1(b)可知，隨著提取溫度的升高，反應(yīng)速率增大，分子熱運動加快，籽油的提取得率先呈上升趨勢，在80 ℃時達到峰值(提取得率5.83%)，繼續(xù)提高提取溫度，溫度過高，成分被破壞，雜質(zhì)溶出提取得率下降，故選取80 ℃為最優(yōu)回流提取溫度。

2.1.3液料比對提取得率的影響 由圖1(c)可知，正己烷-樣品粉末比(液料比)越大，即溶劑用量越大，油脂的提取率先增大后減小。在液料比10 ∶1時達到峰值(提取得率5.83%)，籽油已基本提取完全，繼續(xù)增大液料比，提取得率下降，結(jié)合提取效果與提取成本，最佳液料比為10 ∶1。

a.提取時間extraction time；b.提取溫度extraction temperature；c.液料比值ratio of solid to liquid圖1 提取條件對提取得率的影響Fig.1 Effects of extraction conditions on extraction yield

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1響應(yīng)面回歸模型建立與方差分析 響應(yīng)面試驗結(jié)果見表1,利用Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得到油脂的提取得率(Y)與提取時間(X1)、提取溫度(X2)、液料比值(X3)的回歸方程，對回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Design and results of response surface test

表2 響應(yīng)面方差分析Table 2 Analysis of response surface variance

2.2.2響應(yīng)曲面圖分析 圖2為各因素對提取得率影響的響應(yīng)曲面圖。由圖2(a)可以看出，提取時間與提取溫度對于籽油提取得率的交互作用極顯著,當(dāng)提取時間為60 min、提取溫度為80 ℃時，提取得率達到最大，由等高線圖可知，提取時間相比于提取溫度而言，對提取得率的影響更為顯著。從圖2(b)可以看出，提取時間與液料比對于籽油提取率的交互作用不顯著,當(dāng)提取時間為60 min、、液料比為10 ∶1 時油脂的提取得率達到最大。由圖2(c)可知提取溫度和液料比對于籽油提取率的交互作用顯著,當(dāng)提取溫度為80 ℃，液料比為10 ∶1時提取得率達到最高。從等高線圖可知，提取溫度對提取得率的影響比液料比更為顯著。

2.2.3驗證實驗 通過響應(yīng)面分析得到回流提取圓齒野鴉椿籽油的最佳工藝條件為提取時間62.08 min,提取溫度80.2 ℃，液料比10.14 ∶1，該條件下提取得率的預(yù)測值為5.84%。為驗證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，試驗3次，提取得率分別為5.849%、5.852%和5.851%，平均提取得率為5.851%，相對標(biāo)準偏差(RSD)值為0.005%。驗證試驗籽油提取得率為(5.85±0.001)%，與預(yù)測值接近，兩者的相對誤差為 0.17%，表明響應(yīng)面法建立的回歸模型與真實試驗結(jié)果擬合程度較高，優(yōu)化的工藝條件可靠。

2.3 圓齒野鴉椿籽不同部位油脂測定結(jié)果

2.3.1油脂提取得率 圓齒野鴉椿籽中，種仁占比為(14.0±0.01)%，油脂提取得率為(35.6±0.7)%，出油率與核桃油[15]相當(dāng)；種皮占比為(84.4±0.02)%，油脂提取得率僅為(2.1±0.15)%。

2.3.2成分分析 采用GB 5009.168—2016中的方法，檢測圓齒野鴉椿籽油中各脂肪酸組成,同時對種仁油與種皮油進行氣相色譜分析(見圖3)。

從圓齒野鴉椿籽油中檢出脂肪酸成分18種，分別為十四碳酸甲酯(0.04%)、十五碳酸甲酯(0.02%)、十六碳酸甲酯(6.68%)、順-9-十六碳-烯酸甲酯(0.08%)、十七碳酸甲酯(0.22%)、順-10-十七碳-烯酸甲酯(0.07%)、十八碳酸甲酯(5.53%)、順-9-十八碳-烯酸甲酯(18.54%)、順，順-9，12-十八碳-二烯酸甲酯(45.64%)、二十碳酸甲酯(0.30%)、順-11-二十碳-一烯酸甲酯(0.34%)、順，順，順-9，12，15-十八碳-三烯酸甲酯(0.56%)、順，順-11，14-二十碳-二烯酸甲酯(0.07%)、二十二碳酸甲酯(0.05%)、順-5，8，11，14-二十碳-四烯酸甲酯(0.04%)、二十三碳酸甲酯(0.02%)、二十四碳酸甲酯(0.06%)和順-15-二十四碳-一烯酸甲酯(0.18%)。脂肪酸總檢出率為78.44%，其中，不飽和脂肪酸的量為65.52%；飽和脂肪酸的量為12.92%；含量前3的成分依次為順，順-9,12-十八碳-二烯酸甲酯(亞油酸)、順-9-十八碳-烯酸甲酯(油酸)和十六碳酸甲酯(硬脂酸)，其中亞油酸的量高達45.64%，與芝麻油[16]相當(dāng)，顯示出良好的市場開發(fā)前景，這將為圓齒野鴉椿籽油的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

3 結(jié) 論

3.1以圓齒野鴉椿籽為原料，以正己烷作為提取試劑，回流提取圓齒野鴉椿籽油。在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，結(jié)果得出的最佳工藝條件為：提取時間62.04 min,提取溫度80.2 ℃，液料比10.14 ∶1，該條件下籽油的提取得率為5.85%，提取得率的預(yù)測值和驗證實驗值接近，擬合程度較高，優(yōu)化的工藝條件可靠。

3.2圓齒野鴉椿籽中，種仁占比為(14.0±0.01)%，油脂提取得率為(35.6±0.7)%；種皮占比為(84.4±0.02)%，油脂提取得率僅為(2.1±0.15)%。從圓齒野鴉椿籽油中檢出脂肪酸成分18種，其中，不飽和脂肪酸的量為65.52%。含量最多的3種脂肪酸為亞油酸、油酸、硬脂酸，且亞油酸的量高達45.64%。