3-氰基吡啶轉煙酸菌株的篩選及發(fā)酵條件研究

金如昌，楊競成，李玉山，夏偉

（安徽瑞邦生物科技有限公司，安徽馬鞍山243100）

煙酸（Nicotinic Acid）又稱尼克酸，是一種水溶性維生素，屬于維生素B族，廣泛用于食品、藥物合成和飼料添加劑等。煙酸在生物體內主要以輔酶I、輔酶II 的形式存在，可以增強細胞之間的新陳代謝反應，以抑制心血管疾病，同時也是抗糙皮病的重要因子。目前，市場上主要采用化學法生產(chǎn)煙酸，該方法通常需要高溫、高壓、強酸、強堿等，且產(chǎn)物回收純化過程復雜，生產(chǎn)成本較高，容易對環(huán)境造成污染，不符合綠色化學發(fā)展方向。

隨著生物技術的快速發(fā)展，生物催化生產(chǎn)煙酸已經(jīng)取得了長足的進步。張淑蓉等用腈水解酶131催化3-氰基吡啶直接水解成煙酸，經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化，產(chǎn)物純品收率達到了85%左右。周瓊等從土壤中獲得了一株具有3-氰基吡啶水解酶活性的菌株CCZU10-4，煙酸的產(chǎn)率達到了93.5%。利用腈水解酶作為生物催化劑生產(chǎn)煙酸，大大提升了產(chǎn)品純度，且反應條件溫和，對環(huán)境污染小，具有廣闊的發(fā)展前景。目前國內報道能夠產(chǎn)生腈水解酶菌株還較少，并且酶活較低，后續(xù)的發(fā)酵條件研究也較少。因此篩選出一株高腈水解酶菌株，對于生物法合成煙酸具有重要意義。

本研究從土壤中篩選出腈水解酶菌株NA-6，并對其菌株的培養(yǎng)及合成煙酸的條件進行了初步探究，為煙酸生產(chǎn)提供技術支撐。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

煙酸菌株分離樣品：篩選的土樣采自安徽瑞邦生物科技有限公司實驗室周圍、生產(chǎn)車間周圍、公司花園內以及公司周圍。所有試劑為市購。

培養(yǎng)基配方：

富集培養(yǎng)基：3-氰基吡啶5 g；KHPO0.5 g；KHPO0.5 g；MgSO·7HO 0.5 g；瓊脂20 g；微量元素1 mL；蒸餾水補至1 L；pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g；3-氰基吡啶10 g；KHPO0.2 g；KHPO0.2 g；MgSO·7HO 0.2 g；NaCl 10 g；微量元素1 mL；瓊脂20 g；蒸餾水補至1 L；pH 7.0。

篩選培養(yǎng)基：3-氰基吡啶10 g；KHPO0.5 g；KHPO0.5 g；MgSO·7HO 0.5 g；微量元素1 mL；瓊脂20 g；蒸餾水補至1 L；pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g；可溶性淀粉40 g；3-氰基吡啶5 g；KHPO0.5 g；KHPO0.5 g；MgSO·7HO 0.5 g；微量元素1 mL；蒸餾水補至1 L，pH 7.0。

微量元素：CuSO·5HO 0.06 g；FeCl0.18 g；CaCl0.18 g；MnSO0.15 g；ZnCl0.20 g；CoCl0.5 g ；蒸餾水補至1 L。

儀器：恒溫搖床；超凈工作臺；紫外可見分光光度計等。

1.2 實驗方法

產(chǎn)煙酸菌株的篩選：將土壤樣品用蒸餾水稀釋成1%的濃度接入到富集培養(yǎng)基中，28℃、200 rpm 充分振蕩，富集培養(yǎng)三次，用生理鹽水稀釋成適宜的倍數(shù)，轉入以3-氰基吡啶為唯一氮源的篩選培養(yǎng)基，3～4 d后，挑取單菌落于平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，待長出菌落后，進行平板劃線傳代2～3 次，分離純化菌株。純化的菌株接種于20 mL 種子培養(yǎng)基中，28℃、200 rpm 振蕩培養(yǎng)24 h，按5%的接種量接種于100 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、200 rpm 振蕩培養(yǎng)4 天，采用Berthelot 法（苯酚-次氯酸鹽光度法）測定腈水解酶酶活進行復篩。

發(fā)酵條件的優(yōu)化：分別采用不同的發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基起始pH 值、不同的3-氰基吡啶濃度，經(jīng)培養(yǎng)后測定發(fā)酵液酶活，找出最佳培養(yǎng)條件。

2 結果與討論

2.1菌株篩選

通過富集培養(yǎng)、選擇平板篩選、多次菌株純化共初篩到腈水解酶菌株11 株。對初篩得到的菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，采用苯酚-次氯酸鹽光度法測定發(fā)酵液酶活進行復篩，最終確定產(chǎn)煙酸菌株11 株，其中NA-6 酶活最高，達到了10.21 U/mL，該菌株來自生產(chǎn)車間周圍土樣（表1）。

表1 不同地點菌株酶活測定

2.2 菌株的形態(tài)鑒定

對酶活最高的菌株NA-6 進行形態(tài)鑒定，如圖1 所示，該菌株的菌落形態(tài)較小，卵圓形，邊緣光滑，乳白色，半透明，經(jīng)初步鑒定為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），于2020 年6 月1 日提交至中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），地址：中國·武漢·武漢大學，保藏編號為CCTCCNO：M2020285。

圖1 菌株的形態(tài)鑒定及簡單染色

2.3 腈水解酶產(chǎn)酶發(fā)酵條件研究

以NA-6為實驗菌株進行產(chǎn)酶條件的研究：

2.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH對酶活的影響

為了明確NA-6 產(chǎn)煙酸的最適pH，配制不同pH 值的發(fā)酵培養(yǎng)基，在28℃、200 rpm 振蕩發(fā)酵培養(yǎng)24 h，測定腈水解酶活大小。結果表明：在pH值4.0～7.0時，酶活都是隨著pH值的增大而增大；當pH值大于7.0時，酶活開始下降，pH值在7.0時，產(chǎn)酶最佳，見圖2。

圖2 起始pH對酶活的影響

2.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基溫度對酶活的影響

分別選擇在24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃下，200 rpm 振蕩發(fā)酵培養(yǎng)24 h，然后測定腈水解酶活力大小。圖3 表明，30℃時酶活最大，產(chǎn)酶量最高，24℃～30℃內，隨溫度升高，酶活能力增加。超過30℃時酶活開始下降，可能會引起菌體衰老，難以完成對原料的轉化，所以確定最適的發(fā)酵溫度為30℃。

圖3 溫度對酶活的影響

2.3.3 3-氰基吡啶濃度對酶活的影響

分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入濃度為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%的3-氰基吡啶，測定酶活，圖4 結果表明，隨著濃度的增加，酶活逐漸增加，當3-氰基吡啶濃度為0.3%時，酶活達到最大值，但隨著濃度繼續(xù)增加，酶活也開始下降，說明當3-氰基吡啶濃度達到一定時，再增加其濃度，可能會對細胞產(chǎn)生毒害作用，導致酶活下降。

圖4 3-氰基吡啶濃度對酶活的影響

3 結論

（1）本實驗利用富集培養(yǎng)技術，同時以3-氰基吡啶為唯一氮源，通過平板篩選、菌株純化等從土壤中篩選出11株催化3-氰基吡啶水解為煙酸的產(chǎn)腈水解酶新菌株，其中NA-6 活性最高，酶活達到了10.21 U/mL，經(jīng)初步形態(tài)鑒定該菌株為惡臭假單胞菌。

（2）對一株活性最高的菌株NA-6展開了發(fā)酵條件的優(yōu)化研究，在初始pH 值為7，發(fā)酵溫度30℃，3-氰基吡啶濃度0.3%時，酶活最大，比原始提高了1.89倍。