基于網(wǎng)絡藥理學探討散寒除濕抗毒方治療COVID-19的物質(zhì)基礎和作用機制

廖金花 王 興 彭雙鳳 凌 利 田 鑫 韋祖猛 邵 婧 李 林*

1.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330006; 2.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006

2019年末以來，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)逐漸在全國乃至全球爆發(fā)，引起國內(nèi)外的高度重視，而中醫(yī)藥在COVID-19的治療中發(fā)揮著至關重要的作用。COVID-19屬于中醫(yī)學“疫”病范疇[1]，病因以“濕”為主，可稱之為“濕毒疫”，病位以上焦為主[2]。散寒除濕抗毒方為國醫(yī)大師伍炳彩的自擬方，被納入到“江西省新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)藥防治方案(試行第三版)”(以下簡稱江西方案)中，作為治療寒濕郁肺證的推薦方，在江西省的疫情防治中取得了良好的效果[3]。

寒濕郁肺證是由于疫毒濕寒與伏燥搏結(jié)所致[4]；國醫(yī)大師伍炳彩以“寒溫一統(tǒng)”思想為指導，以《傷寒論》-麻黃加術湯合《溫病條辨》-杏蘇散加減而成，起到散寒祛濕，理肺化痰的功效。方中麻黃為君，開腠理、透毛竅，宣肺平喘；桂枝功效有三：一則解肌發(fā)表，助君藥解表逐邪，二則溫通血脈，暢行營陰，三則化氣行水以利寒濕；白術“主風寒濕痹”(《神農(nóng)本草經(jīng)》)，長于健脾祛濕，配麻黃以發(fā)汗祛濕；杏仁降氣平喘、蘇子降氣化痰、止咳平喘，杏、蘇與麻黃相伍，一宣一降，以助肺氣之宣降；前胡降氣化痰、桔梗與枳殼配伍宣降肺氣，既疏理胸膈氣機，又化痰止咳祛邪，三藥合用，氣順津布則痰消；陳皮、半夏行氣燥濕化痰，以上共為臣藥。茯苓健脾以杜生痰之源；生姜、大棗滋脾行津，調(diào)和脾胃；炙甘草益氣和中，助正達邪，緩和藥性，防溫燥之麻、桂辛散太過而傷元氣之弊，是使藥而兼佐藥之用。諸藥合用，邪正兼顧，共奏散寒除濕，宣降肺氣，理肺化痰之功，為散寒除濕抗毒之方劑。

文章通過網(wǎng)絡藥理學分析散寒除濕抗毒方的潛在有效化學成分、治療靶點及相關通路，為本方治療COVID-19提供理論基礎和科學依據(jù)，亦為本方更好的在國際抗疫中發(fā)揮積極作用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 篩選與獲取散寒除濕抗毒方藥物成分 在TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫據(jù)庫中分別輸入散寒除濕抗毒方全方生麻黃、杏仁、桂枝、炙甘草、炒白術、紫蘇、法半夏、陳皮、前胡、桔梗、枳殼、茯苓、生姜、大棗，以口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性指數(shù)(DL)≥0.18為條件進行篩選，獲得14味中藥潛在的有效成分。

1.2 收集散寒除濕抗毒方對應靶點 基于TCMSP數(shù)據(jù)庫，根據(jù)上述篩選出的散寒除濕抗毒方中14味中藥潛在的有效成分預測作用靶點。

1.3 獲取COVID-19疾病靶點 分別在GeneCard(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫以“Coronavirusdisease 2019”和“coronavirus”為關鍵詞，得到與COVID-19疾病相關的靶點。

1.4 獲取潛在作用靶點 利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫查詢散寒除濕抗毒方可能的作用靶點蛋白對應的基因名，將其基因名和1.3獲取的疾病靶點基因名分別錄入到Venny2.1在線軟件作圖工具平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，制作韋恩圖，獲得交集靶點基因名，作為潛在作用靶點。

1.5 構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖 將中藥化學成分的靶點中與潛在作用靶點相合部分，以及“1.4”所得的潛在作用靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡，使用Network Analyzer功能對藥物中的主要化學成分進行分析，節(jié)點的大小代表度(degree)值的大小。

1.6 構(gòu)建清熱化濕抗毒方對COVID-19疾病的作用靶點蛋白網(wǎng)絡圖 將獲得的潛在作用靶點導入STRING網(wǎng)絡平臺(https://string-db.org/cgi/input.pl)，選擇物種為Homosapiens進行分析，獲得蛋白相互作用關系表，將蛋白相互作用表導入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡圖(PPI)，其中節(jié)點的大小、顏色的深淺變化代表度值的大小，并根據(jù)節(jié)點的度值篩選出核心作用靶點。

1.7 GO和KEGG富集分析 通過Metascape(https://metascape.org/)基因注釋及分析平臺對潛在作用靶點進行富集分析，得到GO(Geneontology)和KEGG(Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)富集分析的柱狀圖，并進行分層聚類，預測散寒除濕抗毒方化學成分主要作用靶點和潛在生物活動機制。為了進一步獲得相關生物活動之間的關系，運用Metascape對GO和KEGG富集通路進行聚類分析，獲取散寒除濕抗毒方治療COVID-19最可能的作用機制。

2 結(jié)果

2.1 中藥活性化合物及靶點的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫以OB≥30%、DL≥0.18篩選后得到散寒除濕抗毒方活性化合物共266個，其中白術7個、半夏13個、陳皮5個、大棗29個、茯苓15個、甘草92個、桂枝7個、桔梗7個、杏仁19個、麻黃23個、前胡25個、生姜5個、枳殼5個、紫蘇14個；通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取中藥成分對應的靶點，其中白術23個、半夏172個、陳皮30個、大棗435個、茯苓30個、甘草1769個、桂枝74個、桔梗92個、杏仁207個、麻黃498個、前胡373個、生姜75個、枳殼123個、紫蘇151個，去掉重復項后共289個。

2.2 潛在作用靶點的預測 根據(jù)GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到COVID-19的疾病靶點355個，在Venny2.1在線軟件作圖工具平臺輸入藥物靶點與疾病靶點，繪制韋恩圖(如圖1所示)，兩者交集部分為潛在作用靶點共59個。

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖的構(gòu)建 將散寒除濕抗毒方潛在的有效成分靶點與59個潛在作用靶點輸入Cytoscape軟件，篩除與靶點無交集的孤立成分，繪制藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖(如圖2所示)。節(jié)點度值(Degree)>15(3倍中位數(shù))的中藥潛在有效成分有7種(詳見表1)，分別為槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、柚皮素、山柰酚、川陳皮素、(+)兒茶素，Degree>40的潛在作用靶點有14個，分別為MAPK3、TNF、IL6、TP53、CASP3、MAPK8、ALB、MAPK1、IL10、IL1B、PTGS2、CXCL8、CCL2、FOS；從表1中發(fā)現(xiàn)大部分為多味中藥的共有化學成分，且每種成分與多個靶點對應，一個靶點又可對應多種成分，體現(xiàn)了散寒除濕抗毒方多味中藥可共同作用于同一靶點，每味中藥又可作用于多個靶點的干預特點，能有效干預COVID-19的多靶點，達到較好的治療效果。

表1 Degree>10的藥物主要化學成分信息

2.4 PPI網(wǎng)絡圖的構(gòu)建 將59個潛在作用靶點錄入STRING數(shù)據(jù)庫中，得到PPI網(wǎng)絡關系信息表，使用Cytoscape軟件對網(wǎng)絡關系信息表進行可視化分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡圖(如圖3所示)。Degree>32.5(中位數(shù))的靶點基因有29個，與2.3中Degree>40的潛在作用靶點相互映射，取交集得到潛在核心靶點IL6、TNF、CASP3、MAPK、PPARG，推測散寒除濕抗毒方可能主要通過以上5個靶點對COVID-19進行干預治療。

為了進一步探討這些潛在靶點之間相互作用的生物過程，運用Metascape以MCODE算法識別靶點之間最密切的生物過程，收集P<0.01，最小計數(shù)為3和富集因子>1.5(富集因子是觀察到的計數(shù)與偶然期望的計數(shù)之比)的術語，并根據(jù)其成分靶點之間相互關系的密切程度得到前3個具有豐富生物過程的核心富集模塊，進行富集分析后按P值劃分，選取3個最佳功能描述(表2)，圖4中左上核心富集模塊主要涉及乙型肝炎、細胞凋亡和弓形蟲病，右上核心富集模塊主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、癌癥的途徑和鞘脂信號通路，左下核心富集模塊主要涉及趨化因子信號通路、細胞因子與細胞因子受體的相互作用和IL-17信號通路。

表2 核心富集模塊功能描述

2.5 富集分析 為探討上述59個交集靶點在治療COVID-19中的作用機制，運用Metascape對59個的靶點進行KEGG(如圖5所示)和GO(如圖6所示)富集分析，KEGG分析得到206條通路途徑，GO分析得到419分子功能、4435個生物學過程、323個細胞組分，KEGG取前20條通路，GO 分子功能、生物學過程和細胞組分分別取前10個作為重點展示。主要涉及的KEGG富集通路主要涉及：糖尿病并發(fā)癥的年齡-憤怒信號通路、MAPK信號通路、趨化因子信號通路；GO生物學過程：細胞因子介導的信號通路、凋亡信號通路、調(diào)節(jié)細胞粘附等；GO細胞組成：膜筏、Bcl-2家族蛋白復合物、轉(zhuǎn)錄因子復合體等；GO分子功能：細胞因子受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、BH3域綁定、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、趨化因子受體結(jié)合等。

3 討論

《說文解字》中提到“疫者，民皆病也”，疫病具有強烈的傳染性，本次COVID-19亦屬于中醫(yī)“疫”病范疇[5]。針對此次疫情，仝小林院士等[6]通過實際調(diào)查，初步提出本病歸屬于“寒濕疫”，認為“寒濕”是COVID-19爆發(fā)的關鍵因素。國醫(yī)大師伍炳彩認為對于COVID-19寒濕兼燥者，當以麻黃加術湯去寒濕，合用杏蘇散治涼燥，故自擬散寒除濕抗毒方用于治療寒濕兼燥的新冠肺炎[7]，現(xiàn)已被納入到江西方案中作為推薦方，為新冠肺炎治療提供了江西方案。

本研究共篩選出散寒除濕抗毒方治療COVID-19的148個成分，運用Cytoscape 3.7.2通過中位Degree值篩選得到7個主要潛在成分，其中6種為黃酮類化合物，分別為槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、柚皮素、山柰酚、川陳皮素，另1種為黃烷衍生物(+)兒茶素。散寒除濕抗毒方與COVID-19有59個交集靶點，通過PPI網(wǎng)絡與“藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡”相映射發(fā)現(xiàn)本方可能主要通過作用于IL6、TNF、CASP3、MAPK、PPARG等潛在核心靶點，改善新冠肺炎患者臨床癥狀，從而達到干預COVID-19的效果。

3.1 散寒除濕抗毒方通過調(diào)節(jié)免疫-炎癥反應干預COVID-19 COVID-19入侵人體后可誘導過度的炎癥反應，導致彌漫性肺損傷、ARDS、多器官衰竭甚至死亡。因此，調(diào)控免疫-炎癥反應是治療COVID-19，改善臨床癥狀的途徑之一[8]；涉及的化合物有：槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、柚皮素、山柰酚、川陳皮素；涉及的靶點有：PTGS2、TNF、IL6、IL-10。

有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能抑制巨噬細胞分泌PTGS2，刺激巨噬細胞進一步分化成熟，成為活化巨噬細胞，增強吞噬功能，從而調(diào)節(jié)免疫炎癥反應[9]；又有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以抑制單純皰疹病毒1型感染誘導的IRF-3和NF-JB的激活，減少RAW264.7細胞產(chǎn)生的炎癥因子：腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[10]。β-谷甾醇可通過下調(diào)IL6和TNF-α水平，改善炎癥反應[11]；柚皮素能通過抑制環(huán)氧合酶(COX)，減少前列腺素PGE2的合成，減少炎性因子的釋放，調(diào)節(jié)免疫炎癥反應[12]；山柰酚可減少促炎細胞因子(IL-12和TNF-α)的釋放，并通過抑制IKK的磷酸化和IKBα的降解來調(diào)節(jié)NF-KB的水平，從而改善CPL介導的炎癥[13]；川陳皮素能抑制腎小球系膜細胞HBZY-1炎癥因子MCP-1和IL6的表達水平，減輕炎癥反應[14]；(+)兒茶素中所含的要表沒食子兒茶酚沒食子酸(EGCG)及表沒食子兒茶酚(EGC)在MDCK細胞中對流感病毒的復制具有抑制活性，其中EGCG可能與病毒粘合，防止病毒入侵MDCK細胞，間接減輕炎癥反應[15]。

3.2 散寒除濕抗毒方可能通過調(diào)控細胞凋亡干預COVID-19 細胞凋亡主要有三種途徑：線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。冠狀病毒主要通過外在途徑(死亡受體通路)誘導細胞凋亡。散寒除濕抗毒方可通過PARP1、CASP3、CASP8、MAPK1、MAPK3、MAPK8、TNF、TP53等靶點調(diào)控細胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)：SADS-CoV感染時細胞可出現(xiàn)明顯的CPE，顯微鏡下可見凋亡細胞胞質(zhì)固縮和細胞膜融合、染色質(zhì)凝縮并附在核膜周邊，形成凋亡小體[16]。Fas/CD95 是細胞膜上主要的死亡受體，許多冠狀病毒的S蛋白可誘導激活細胞膜死亡受體，最終引起由 Caspase 級聯(lián)信號途徑誘導的細胞凋亡[17]。SARS-CoV誘導的細胞凋亡依賴于Caspase家族，Caspase抑制劑過表達可抑制細胞凋亡[18]。木犀草素既能通過調(diào)控CASP8、CASP3的表達干預流感病毒誘導的細胞凋亡[18]，又能通過降低過氧化物酶活性、TNF-α和IL6水平，以及提高IL-4和IL-10水平，抑制NF-KB，從而抑制細胞凋亡途徑[18]；新冠患者心肌細胞或激活后白細胞釋放的TNF、IL6具有啟動凋亡程序的作用[23]。散寒除濕抗毒方可通過調(diào)控細胞凋亡過程，進而對COVID-19進行干預。

3.3 散寒除濕抗毒方可能通過鞘脂類信號通路干預COVID-19 鞘脂類通路激活,可使血管通透性增加,表面活性劑鈍化,肺泡上皮細胞凋亡,誘發(fā)肺水腫[24]。散寒除濕抗毒方可通過靶點：BAX、BCL2、MAPK14、NOS3、PRKCA、PRKCB、MAPK1、MAPK3、MAPK8、RELA、TNF、TP53調(diào)節(jié)鞘脂類信號通路，緩解肺水腫及肺組織損傷。

國內(nèi)第一例新冠尸體解剖發(fā)現(xiàn)：右肺嚴重淤血，肺水腫，心外膜水腫。故調(diào)節(jié)血管屏障對新冠肺炎的治療具有重要的臨床意義[25-26]。而鞘脂類物質(zhì)是一種極其重要的血管生成因子和具有強大的血管屏障調(diào)節(jié)特性的信號介質(zhì)。鞘氨醇1-磷酸(S1P)是神經(jīng)鞘磷脂代謝產(chǎn)生的一種有生物活性的脂類，由神經(jīng)酰胺代謝產(chǎn)生，S1P已在體外被證實了具有增強肺血管屏障的功能[27-29]；血小板一直被認為可以降低血管內(nèi)皮通透性，研究發(fā)現(xiàn)，S1P是人類血小板產(chǎn)生的關鍵屏障保護性介質(zhì)[30]；S1PR4和S1PR5可與Giand G12/13偶聯(lián)，通過G12/13的信號可以抑制遷移，降低內(nèi)皮屏障功能，并通過促進GTPase Rho和Rho相關激酶(ROCK)的激活來誘導血管收縮；S1P還能有效減輕NOS2刺激的肺損傷[30]。散寒除濕抗毒方中的化合物山奈酚、槲皮素、木犀草素都具有調(diào)控鞘脂類信號通路的作用。

綜上可知，散寒除濕抗毒方可通過調(diào)節(jié)免疫-炎癥反應，以及通過調(diào)控細胞凋亡及鞘脂類信號通路，對COVID-19進行干預。散寒除濕抗毒方作為國醫(yī)大師伍炳彩的自擬方，被選入“江西方案”中作為推薦方，其對于新冠肺炎的治療效果在臨床中也已經(jīng)得以證實。本研究通過對散寒除濕抗毒方的藥物潛在有效成分、潛在作用靶點及相關通路進行分析，預測散寒除濕抗毒方治療COVID-19的潛在作用機制，為中醫(yī)藥治療COVID-19提供一定的理論基礎和科學依據(jù)，為后續(xù)研究及開發(fā)院內(nèi)制劑提供參考。