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      T9SS蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)及其在微生物降解多糖過程中的功能

      2021-03-01 09:18:24陳曉藝
      關(guān)鍵詞:分泌系統(tǒng)外膜錨定

      陳曉藝,方 程,王 辛,趙 鑫

      (大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116034)

      0 引 言

      分泌系統(tǒng)在細(xì)菌的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用,細(xì)胞通過分泌系統(tǒng)從外界環(huán)境中攝取營養(yǎng)物質(zhì)、進(jìn)行細(xì)胞間的信號(hào)傳遞、分泌毒力(致病)因子以及抵御宿主免疫系統(tǒng)的攻擊等[1-3]。近幾十年來,人們對(duì)革蘭氏陰性菌的蛋白質(zhì)分泌途徑進(jìn)行了深入的研究,迄今共發(fā)現(xiàn)了9種不同類型的分泌系統(tǒng),分別被命名為Ⅰ~Ⅸ型分泌系統(tǒng)。待分泌的物質(zhì)通過貫穿細(xì)胞被膜的專一性通道被直接運(yùn)送到胞外(T1SS、T3SS、T4SS、T6SS),或先通過細(xì)胞內(nèi)膜上的Sec通道從胞質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)空間,再進(jìn)一步跨細(xì)胞外膜被分泌至胞外(T2SS、T5SS、T7SS、T8SS、T9SS)[4-6]。

      其中,T9SS是新近發(fā)現(xiàn)的一類蛋白分泌系統(tǒng),最初也被稱為PorSS系統(tǒng),僅在擬桿菌門的部分微生物中存在,具有較高的種屬特異性[6-8]。以T9SS為分泌系統(tǒng)的微生物主要是牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)和約氏黃桿菌(Flavobacteriumjohnsoniae),前者是主要的牙周炎致病菌,后者則是一種常見的環(huán)境微生物,具有滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)的特征。目前已經(jīng)鑒定到很多通過T9SS轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì),它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上具有一定的共性,除了具有N末端信號(hào)肽外,C末端還普遍存在一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域——CTD。CTD由大約80個(gè)氨基酸殘基組成,負(fù)責(zé)引導(dǎo)蛋白質(zhì)跨越細(xì)胞外膜而被運(yùn)送至胞外[9]。圍繞T9SS的結(jié)構(gòu)、功能以及相關(guān)分泌蛋白的性質(zhì)已展開了許多研究,取得了一定的進(jìn)展。

      1 T9SS的發(fā)現(xiàn)

      T9SS最初在牙齦卟啉單胞菌P.gingivalis中被發(fā)現(xiàn),該菌株屬于革蘭氏陰性菌,專性厭氧,是誘發(fā)牙周炎的主要病原菌之一[10]。P.gingivalis能夠向胞外大量分泌一系列牙齦蛋白酶,它們大部分吸附在細(xì)胞外膜的外表面上,少部分以游離狀態(tài)存在。這些蛋白酶能夠攻擊和破壞宿主的先天防御機(jī)制,是重要的毒力因子[10]。P.gingivalis在血瓊脂平板上培養(yǎng)時(shí),由于亞鐵血紅素在細(xì)胞表面積累,菌落正常呈黑色,而這與細(xì)胞表面牙齦蛋白酶的蛋白水解活性及其與血凝素和血紅蛋白的結(jié)合能力密切相關(guān)[11]。自發(fā)突變產(chǎn)生的白色或淺褐色突變株,其細(xì)胞表面的蛋白酶活性均顯著下降[11]。因此,牙齦蛋白酶的胞外活性與P.gingivalis菌落顏色之間的正相關(guān)性成為研究菌株蛋白分泌途徑的有效篩選工具。

      PorT(PG0751/PGN_0778)是第一個(gè)被成功鑒定的編碼牙齦蛋白酶分泌途徑中關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因,它的缺失導(dǎo)致突變株的胞外牙齦蛋白酶活性顯著降低,大量的酶蛋白以沒有活性的酶原形式滯留在細(xì)胞周質(zhì)空間中[12]。研究者們將含有PorT基因的牙齦卟啉單胞菌與不含有PorT基因的多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的蛋白質(zhì)組/基因組進(jìn)行了比對(duì),從中篩選出除PorT外另外55個(gè)可能參與的基因。隨后,通過對(duì)這些基因進(jìn)行同源基因突變實(shí)驗(yàn),最終確定了11個(gè)與牙齦蛋白酶跨細(xì)胞外膜轉(zhuǎn)運(yùn)及激活過程相關(guān)的基因。由于以上基因編碼的蛋白質(zhì)與其他已知分泌系統(tǒng)(T1SS-T8SS)的任何組分都沒有序列相似性,因此研究者們認(rèn)定這是一個(gè)全新的分泌系統(tǒng),并將其命名為PorSS分泌系統(tǒng)[7],該系統(tǒng)各組分蛋白的命名大多以“Por”為前綴,以表示這些蛋白質(zhì)在牙齦蛋白酶分泌過程中的重要作用,而后者則與細(xì)胞產(chǎn)卟啉類黑色素密切相關(guān)[13]。為了與已有分泌系統(tǒng)命名一致,后又將其更名為Ⅸ型分泌系統(tǒng),即T9SS[9,14]。

      隨著T9SS在擬桿菌門中的發(fā)現(xiàn),越來越多研究表明,不僅是P.gingivalis,很多其他病原微生物如福賽斯坦納菌(Tannerellaforsythia)和鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer)等,同樣是利用這一系統(tǒng)向胞外分泌毒力因子或效應(yīng)蛋白,從而具有入侵宿主細(xì)胞以及抵御宿主免疫系統(tǒng)攻擊的能力[15-18]。另一方面,以哈氏噬纖維菌(Cytophagahutchinsonii)和約氏黃桿菌(Flavobacteriumjohnsoniae)為代表的非病原環(huán)境微生物,也通過T9SS向胞外分泌幾丁質(zhì)酶和纖維素酶,使細(xì)胞能夠利用幾丁質(zhì)和纖維素等生物大分子作為營養(yǎng)物質(zhì)。同時(shí),這兩類微生物細(xì)胞都具有滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)的特性,而研究發(fā)現(xiàn)T9SS的核心組件本身也是重要的滑動(dòng)蛋白編碼基因[7-8,19]。所以,對(duì)不同的擬桿菌門微生物而言,T9SS既可以是病原菌攻擊宿主細(xì)胞的有力武器,也可以是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及從外界環(huán)境攝取營養(yǎng)物質(zhì)的有效工具[20-21]。

      2 T9SS的組成

      T9SS本身是一個(gè)多蛋白復(fù)合體,以P.gingivalis的T9SS為例,目前已知至少由18個(gè)組分構(gòu)成(PorT、Sov、PorK、PorL、PorM、PorN、PorP、PorQ、PorU、PorW、PorV、PorX、PorY、PorZ等),整體結(jié)構(gòu)跨越了細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)膜、周質(zhì)空間和細(xì)胞外膜。實(shí)驗(yàn)證實(shí),敲除任何一個(gè)基因,都會(huì)導(dǎo)致突變株菌落呈白色,且分泌蛋白在周質(zhì)空間非正常積累[22]。P.gingivalis的T9SS結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖1所示[23]。

      在P.gingivalis的基因組中,porPKLMN這5個(gè)基因連續(xù)排列并且同時(shí)轉(zhuǎn)錄,但PorP蛋白的表達(dá)水平比其他4個(gè)蛋白要低很多,研究者推測(cè)可能有單獨(dú)的啟動(dòng)子負(fù)責(zé)調(diào)控porKLMN這5個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄[24]。PorK是嵌于細(xì)胞外膜上的一個(gè)脂蛋白,與PorN相連接,PorL和PorM兩個(gè)蛋白則位于細(xì)胞內(nèi)膜上(圖1)。這5個(gè)蛋白共同組成了一個(gè)分子質(zhì)量超過1 000 ku的復(fù)合體,構(gòu)成了跨細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)通道[7]。同樣,在F.johnsoniae中,這4個(gè)蛋白在細(xì)胞滑動(dòng)和代謝幾丁質(zhì)的過程中也起著關(guān)鍵作用,重要的滑動(dòng)黏附素SprB和RemA都是通過這一通道被分泌到胞外的[19]。在眾多T9SS的外膜組分中,PorK和PorN被認(rèn)為是細(xì)胞分泌物質(zhì)以及滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)最不可或缺的兩個(gè)蛋白。結(jié)構(gòu)分析表明,二者均具有32~36個(gè)亞基組成的大型環(huán)狀結(jié)構(gòu),直徑50 nm,高度約7 nm,且環(huán)狀結(jié)構(gòu)大部分位于外膜的周質(zhì)空間一側(cè)。據(jù)推測(cè),PorK或PorN的環(huán)狀結(jié)構(gòu)至少有一部分參與組成了外膜上的運(yùn)輸孔道[25]。

      圖1 P.gingivalis的T9SS的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Structural prediction of T9SS of P.gingivalis

      根據(jù)現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù),大多數(shù)通過T9SS分泌的蛋白都是錨定在細(xì)胞外膜的表面,而非游離釋放到培養(yǎng)基中。在P.gingivalis中,分泌蛋白在一個(gè)轉(zhuǎn)肽酶的作用下切除C末端的部分肽段(轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)),并與脂多糖A-LPS共價(jià)結(jié)合,進(jìn)而被錨定在細(xì)胞外膜上,這個(gè)轉(zhuǎn)肽酶即PorU[26]。PorU與其他3個(gè)蛋白(PorV、PorQ和PorZ)一起共同構(gòu)成了一個(gè)“附著復(fù)合體”,在分泌蛋白錨定到外膜的過程中起關(guān)鍵作用[27]。PorV和PorQ都是外膜上的內(nèi)在蛋白,而PorU則通過PorV而被錨定在外膜上[28]。缺失PorU和PorZ基因的突變菌株,分泌蛋白會(huì)部分游離釋放到培養(yǎng)基中,且其C末端信號(hào)肽未被切除[26-27],由此推測(cè)PorU和PorZ參與了分泌蛋白信號(hào)肽切除及與A-LPS的結(jié)合過程。PorU的主要功能是作為轉(zhuǎn)肽酶進(jìn)行肽段的切除,而PorZ則主要通過識(shí)別脂多糖A-LPS的甘露糖重復(fù)單元,幫助分泌蛋白與A-LPS共價(jià)結(jié)合。同時(shí),PorZ對(duì)PorU在外膜上的固定也起到了一定的作用。相反,缺失PorV和PorQ基因的P.gingivalis突變菌株,細(xì)胞表面則完全沒有錨定分泌蛋白[27]。實(shí)驗(yàn)表明,PorV與PorU的功能有相似之處,也能夠錨定細(xì)胞分泌的蛋白,在敲除PorU的突變株中,分泌蛋白可通過PorV的作用而被錨定在細(xì)胞表面。

      除蛋白外,T9SS還包含很多其他組分,但目前對(duì)它們的結(jié)構(gòu)和功能研究報(bào)道相對(duì)較少。PorP雖然在基因組中與PorKLMN相連,但PorP的蛋白表達(dá)水平幾乎比另外4個(gè)蛋白低了20倍。盡管PorP在空間結(jié)構(gòu)上與PorK等其他組分相連,但卻不是外膜上分泌通道的核心組成成分。在約氏黃桿菌F.johnsoniae中存在多個(gè)PorP的同源基因,SprF是其中之一。在基因組上,SprF與SprB相連,后者編碼一種滑動(dòng)黏附蛋白。SprF對(duì)SprB的分泌表達(dá)至關(guān)重要,但SprF的敲除并不影響細(xì)胞的滑動(dòng)性,說明細(xì)胞還存在其他PorP同源基因在調(diào)控滑動(dòng)黏附蛋白的分泌表達(dá)[29]。PG1058也是P.gingivalis細(xì)胞T9SS的一個(gè)重要組分,它的發(fā)現(xiàn)相對(duì)較晚[22]。PG1058是一個(gè)脂蛋白,定位于細(xì)胞的周質(zhì)空間,由TolB和肽聚糖結(jié)合模塊組成。與PorP類似,PG1058在F.johnsoniae及其他滑動(dòng)細(xì)菌中也存在多個(gè)同源蛋白,推測(cè)可能參與了某些特定底物的分泌表達(dá)。PorT和Sov是最先被鑒定的兩個(gè)T9SS組分,但是它們的功能至今尚未得到解析。PorT、Sov和PorW都是P.gingivalis細(xì)胞T9SS的基本組成成分,在F.johnsoniae中,這3個(gè)基因的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不能正常分泌幾丁質(zhì)酶,但不影響細(xì)胞的滑動(dòng)性。

      PorX和PorY兩個(gè)蛋白既是T9SS的組成成分,也是系統(tǒng)的調(diào)控因子。PorX是響應(yīng)調(diào)控因子同源蛋白,PorY是組氨酸激酶感應(yīng)蛋白[30]。敲除其中任何一個(gè)基因,都導(dǎo)致T9SS各組分表達(dá)下調(diào),同時(shí)細(xì)胞的牙齦蛋白酶活性降低[7,31]。研究表明,PorY能夠自我磷酸化,并與PorX相互作用,使得后者也被磷酸化修飾。PorX在細(xì)胞質(zhì)中與信號(hào)分子SigP結(jié)合,后者又進(jìn)一步與T9SS各組分基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合[31]。由此,PorY感應(yīng)來自周質(zhì)空間的信號(hào),并通過PorX和SigP級(jí)聯(lián)反應(yīng)來上調(diào)T9SS各組分基因的表達(dá)。

      3 T9SS的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

      蛋白質(zhì)通過T9SS分泌運(yùn)輸?shù)倪^程可分為兩步。首先,分泌蛋白在其自身N端信號(hào)肽的引導(dǎo)下,通過細(xì)胞內(nèi)膜上的Sec轉(zhuǎn)運(yùn)通道被運(yùn)送至周質(zhì)空間;然后,信號(hào)肽被切除,蛋白質(zhì)折疊成具有穩(wěn)定構(gòu)象的結(jié)構(gòu)。其次,蛋白質(zhì)進(jìn)一步在其CTD的引導(dǎo)下,通過細(xì)胞外膜上的易位子被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外。已有研究結(jié)果表明,所有通過T9SS運(yùn)送的蛋白質(zhì)普遍具有保守的CTD結(jié)構(gòu)域。以牙齦蛋白酶RgpB為例,去掉C末端72個(gè)氨基酸殘基的突變體蛋白只能在細(xì)胞周質(zhì)空間中積聚,不能被分泌到胞外[9]。CTD的完整性對(duì)RgpB的分泌至關(guān)重要,即使僅僅缺失2個(gè)氨基酸殘基,或者其中保守氨基酸殘基發(fā)生突變,都直接導(dǎo)致蛋白質(zhì)不能夠被正常分泌[15]。

      與其他分泌系統(tǒng)相比,T9SS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)有其獨(dú)特的特點(diǎn),即被轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)大多數(shù)都被錨定在細(xì)胞表面,只有少數(shù)以游離狀態(tài)分泌到培養(yǎng)基質(zhì)中。實(shí)驗(yàn)表明,錨定在外膜上的分泌蛋白,其分子質(zhì)量通常比理論值大20 ku左右,這是由于蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合了一個(gè)脂多糖分子A-LPS[32]。A-LPS本身是鑲嵌在細(xì)胞外膜上的,從而使與之結(jié)合的蛋白質(zhì)被錨定在了細(xì)胞表面。在電鏡下觀察P.gingivalis細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)被錨定在細(xì)胞表面的牙齦蛋白酶形成了一層包裹著細(xì)胞的致密電子層[26]。A-LPS合成有缺陷的突變株細(xì)胞表面則沒有電子層包裹,細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)均以游離態(tài)被釋放到培養(yǎng)基中[33]。A-LPS與分泌蛋白的結(jié)合機(jī)制目前尚未得到解析,推測(cè)這一過程主要是在PorU的作用下完成的。PorU具有轉(zhuǎn)肽酶功能,能夠切除分泌蛋白的CTD結(jié)構(gòu)域,隨后將新生成的C末端與A-LPS通過一段連接肽結(jié)合起來,而這一模式與革蘭氏陽性菌細(xì)胞表面蛋白質(zhì)與肽聚糖層的結(jié)合十分相似[34]。

      4 T9SS轉(zhuǎn)運(yùn)的典型蛋白

      通過T9SS轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì),按照功能不同大致可分為兩類:一類是能夠分解復(fù)雜生物大分子的酶,包括蛋白酶、糖苷水解酶(主要是幾丁質(zhì)酶和纖維素酶)、核酶和脂酶等;另外一類則主要是黏附素、血細(xì)胞凝集素以及一些富含亮氨酸的蛋白質(zhì)等。

      P.gingivalis產(chǎn)生的牙齦蛋白酶RgpA、RgpB和Kgp是研究相對(duì)深入的T9SS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。它們是細(xì)胞分泌的主要毒力因子,能夠結(jié)合肽段和血紅素,攝取血紅蛋白為細(xì)胞提供營養(yǎng);同時(shí),它們通過自身的吸附性以及異常調(diào)節(jié)宿主的免疫防御和炎癥響應(yīng)系統(tǒng),在細(xì)胞致病機(jī)理中也發(fā)揮著重要作用[35-36]。類似的,T.forsythia利用T9SS分泌一系列毒素因子,包括各種細(xì)胞表層蛋白、富含亮氨酸的重復(fù)蛋白以及一類被稱為KLIKK的蛋白酶等[17,37-38]。其中兩個(gè)重要的分泌蛋白TfsA和TfsB構(gòu)成了細(xì)胞表面的S層。S層結(jié)構(gòu)較為規(guī)則,在細(xì)胞表面形成了一層被膜,能夠幫助菌株黏附并入侵人牙齦上皮細(xì)胞,且能夠延遲人體免疫系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的識(shí)別[39]。

      C.hutchinsonii能夠高效降解結(jié)晶纖維素,且降解過程依賴于完整的活細(xì)胞。已有研究證實(shí),該菌株利用T9SS向胞外分泌纖維素酶,并將酶蛋白錨定在細(xì)胞表面[20]。SprP是C.hutchinsonii細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的PorP(P.gingivalis)同源蛋白,基因敲除實(shí)驗(yàn)表明,SprP基因缺失的突變株失去纖維素降解能力,且依賴于T9SS分泌的胞外蛋白CHU_3105含量也顯著降低;同時(shí),突變株也喪失了在纖維素表面的滑動(dòng)能力,推測(cè)可能與滑動(dòng)蛋白SprB不能夠被正常分泌有關(guān)[20]。已知C.hutchinsonii基因組中有147個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)含有CTD結(jié)構(gòu)域,包括5個(gè)β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶以及大量與纖維素和其他多糖結(jié)合和降解相關(guān)的蛋白質(zhì)。C.hutchinsonii細(xì)胞能夠在纖維素表面滑動(dòng)、與纖維素底物吸附以及降解結(jié)晶纖維素的過程均與T9SS轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)密切相關(guān)。

      C.hutchinsonii的細(xì)胞外膜上存在許多纖維素酶組分,它們可能共同構(gòu)成了一個(gè)蛋白復(fù)合體[40]。例如,蛋白CHU_3220的C末端具有保守的CTD結(jié)構(gòu)域,定位在細(xì)胞外膜上,可與纖維素結(jié)合,是菌株降解結(jié)晶纖維素過程中不可或缺的一個(gè)酶組分。敲除CHU_3220基因后,突變株細(xì)胞表面的內(nèi)切葡聚糖酶活性顯著降低,說明CHU_3220基因可能同時(shí)調(diào)控了其他內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)[40]。CHU_1276和CHU_1277也是兩個(gè)外膜蛋白,二者本身都不具有纖維素酶活性,但均參與調(diào)控多個(gè)纖維素酶基因的表達(dá)或者與維持細(xì)胞表面的纖維素酶活性密切相關(guān)[41-42]。Zhu等[43]系統(tǒng)研究了C.hutchinsonii的所有內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因及其編碼蛋白的細(xì)胞定位和活性,發(fā)現(xiàn)其中5個(gè)酶蛋白(Cel5A、Cel9A、Cel9B、Cel9D和Cel9E)是通過T9SS被分泌并錨定在細(xì)胞外膜上,它們負(fù)責(zé)將纖維素分解為小分子的纖維寡糖,繼而跨過細(xì)胞外膜被運(yùn)送至周質(zhì)空間,再進(jìn)一步被定位于周質(zhì)空間的兩個(gè)內(nèi)切酶Cel5B和Cel9C分解,由此共同組成了一個(gè)完整的纖維素降解酶系。

      F.johnsoniae與C.hutchinsonii同屬擬桿菌門,具有滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)能力,并且能夠降解幾丁質(zhì)。研究表明,F(xiàn).johnsoniae利用T9SS向胞外分泌滑動(dòng)黏附蛋白SprB和RemA,使菌體細(xì)胞能夠在固體表面滑動(dòng)[19]。SprB蛋白的分子質(zhì)量大小為669 ku,是一個(gè)高度序列重復(fù)的蛋白質(zhì),它從外膜開始形成向外的長絲狀,并沿細(xì)胞表面呈螺旋狀運(yùn)動(dòng)[44]。在F.johnsoniae細(xì)胞中還含有多個(gè)SprB同源蛋白,它們可能賦予細(xì)胞在不同固體表面滑動(dòng)的能力。RemA的分子質(zhì)量為152 ku,與SprB一樣呈螺旋狀運(yùn)動(dòng)。RemA蛋白中心含有一個(gè)凝集素結(jié)構(gòu)域,能夠結(jié)合細(xì)胞自身分泌的多糖[45]。F.johnsoniae正是借助SprB和RemA等蛋白來推動(dòng)細(xì)胞的自我滑動(dòng),而這些黏附蛋白如何錨定在細(xì)胞外膜上并沿著一定軌跡運(yùn)動(dòng)的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

      F.johnsoniae能夠分泌幾丁質(zhì)酶ChiA,該蛋白由兩個(gè)GH18家族結(jié)構(gòu)域組成,分子質(zhì)量為168.9 ku。ChiA基因的插入突變導(dǎo)致細(xì)胞失去利用幾丁質(zhì)的能力,表明ChiA是該菌株降解幾丁質(zhì)的關(guān)鍵酶蛋白。與上述大多數(shù)T9SS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不同的是,ChiA是以游離態(tài)被分泌到培養(yǎng)基質(zhì)中,而不是錨定在細(xì)胞表面;同時(shí),序列分析結(jié)果顯示,ChiA的CTD與已知的其他CTD序列相似性很低,可能是一種新型的CTD[46]。因此,CTD或許是決定T9SS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白細(xì)胞定位的關(guān)鍵影響因素。此外,GldK、GldL、GldM、GldN、SprA、SprE或SprT等編碼滑動(dòng)蛋白相關(guān)基因的缺失則會(huì)導(dǎo)致分泌的ChiA被錨定在細(xì)胞外膜上,說明F.johnsoniae的很多滑動(dòng)蛋白本身也是T9SS的組成成分,它們除了賦予細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力,同時(shí)也直接參與酶蛋白的胞外轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

      5 總結(jié)與展望

      與其他已知蛋白分泌系統(tǒng)相比,T9SS的功能與運(yùn)送機(jī)制相對(duì)較為獨(dú)特,主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面:一是其組成構(gòu)造較為復(fù)雜,由分布在細(xì)胞內(nèi)膜、周質(zhì)空間和細(xì)胞外膜上的多個(gè)組分相互連接構(gòu)成,所轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白底物首先跨細(xì)胞內(nèi)膜被運(yùn)送至周質(zhì)空間,經(jīng)過一定加工后再進(jìn)一步穿過細(xì)胞外膜被運(yùn)送到胞外;二是被運(yùn)送到胞外的蛋白質(zhì),大多數(shù)不能夠游離分泌到培養(yǎng)基質(zhì)中,而是通過與外膜上的脂多糖A-LPS共價(jià)結(jié)合而被錨定在細(xì)胞表面,并由此形成S層被膜結(jié)構(gòu)(某些微生物中)。因此,以T9SS作為細(xì)胞主要蛋白分泌系統(tǒng)的微生物,它們的致病性、運(yùn)動(dòng)性、降解生物大分子等生理功能與細(xì)胞膜上的錨定蛋白密切相關(guān)。

      盡管已經(jīng)初步了解了T9SS的組成及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)模式,但對(duì)其各組分的結(jié)構(gòu)和功能、各組分之間如何相互連接形成復(fù)雜的蛋白復(fù)合體、蛋白質(zhì)如何通過外膜上的運(yùn)送孔道以及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程的調(diào)控機(jī)理等具體信息還知之甚少。隨著生物學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展,特別是冷凍電鏡(crys-EM)技術(shù)的應(yīng)用,將有助于更好地了解T9SS這一復(fù)雜“細(xì)胞機(jī)器”的構(gòu)造,解析蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

      以C.hutchinsonii和F.johnsoniae為代表的微生物能夠吸附在不溶性多糖底物表面并進(jìn)行滑動(dòng),它們降解多糖的過程依賴于細(xì)胞與底物的緊密吸附。錨定在細(xì)胞外膜上的多糖降解酶在底物降解過程起著至關(guān)重要的作用,但它們是如何被轉(zhuǎn)運(yùn)并錨定在細(xì)胞表面、CTD是否影響酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)及活性、纖維寡糖又是如何被轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)空間等問題目前尚未得到解析。對(duì)T9SS結(jié)構(gòu)和功能的深入解析將有助于更清晰地了解微生物的多糖降解機(jī)制,或許也有助于發(fā)現(xiàn)新型的多糖降解酶類,從而為工業(yè)酶制劑的研發(fā)提供新的思路。

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