食品中鏈霉素的可視化免疫親和凝膠柱快速檢測(cè)

王敏思，朱文博，趙凌燕，柳 雙，宋 洋

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué) 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

鏈霉素（streptomycin，STR）是一種氨基酸糖苷類抗生素藥物[1]，對(duì)結(jié)核桿菌和許多革蘭氏陰性桿菌有較強(qiáng)的抗菌作用[2]，是目前我國(guó)畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)中的常用藥物之一[3]，但同時(shí)也導(dǎo)致畜禽和水產(chǎn)有機(jī)體以及產(chǎn)物（如奶類、肉類等）中高濃度鏈霉素藥物滯留和蓄積[4]，并以食物鏈方式進(jìn)入人體，危害人類健康[5].鏈霉素有嚴(yán)重的腎毒性和耳毒性，長(zhǎng)期攝入有鏈霉素殘留的食物會(huì)造成腎臟及前庭功能和耳蝸神經(jīng)永久性損傷[6]，食物中殘留的鏈霉素可能會(huì)造成過(guò)敏反應(yīng)甚至引起休克[7]，研究表明鏈霉素還具有潛在的致畸作用[8].臨床上，鏈霉素已逐漸被其他效果類似的藥物所取代，但畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)中仍在繼續(xù)使用[9].因此建立準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)方法很有必要.

目前，鏈霉素在多個(gè)國(guó)家（地區(qū)）均允許使用，但因其對(duì)人體的危害性，我國(guó)及世界其他國(guó)家（地區(qū)）對(duì)其殘留限量均做出了規(guī)定.其中，我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定牛奶、豬肉和牛肉中鏈霉素的最高殘留限量分別為200、600 和600 μg/kg：歐盟國(guó)家及日本均規(guī)定牛奶、豬肉和牛肉中鏈霉素的最高殘留限量分別為200、500 和500 μg/kg[10-11].國(guó)內(nèi)外定量鏈霉素殘留的檢測(cè)方法以傳統(tǒng)的高效液相色譜法（HPLC）[12-13]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）[14-16]和酶聯(lián)免疫法（ELISA）[17-19]為主，但傳統(tǒng)方法存在成本高、自動(dòng)化程度低、時(shí)間較長(zhǎng)等問(wèn)題[20].近年來(lái)，簡(jiǎn)單、快速的新型免疫化學(xué)分析方法逐步被建立并廣泛應(yīng)用[16].

免疫親和凝膠柱（IATC）是基于免疫親和原理發(fā)展起來(lái)的一種新型的可視化快速檢測(cè)方法[21-23]，該方法將抗體固化在溴化氰活化的瓊脂糖凝膠上形成檢測(cè)層和質(zhì)控層，利用抗原抗體的特異性反應(yīng)，最終根據(jù)檢測(cè)層顏色變化情況確定檢測(cè)結(jié)果[24-25].同傳統(tǒng)方法相比，該方法具有操作容易、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)[17]. 2012 年，Meng 等[26]建立了IATC 法現(xiàn)場(chǎng)快速篩查蜂蜜和水產(chǎn)中氯霉素的殘留，樣品經(jīng)簡(jiǎn)單預(yù)處理即可進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)僅需10 min 即可完成，該方法的檢出限（LOD）為1 μg/kg；2014 年，Xu 等[27]建立了IATC 法檢測(cè)牛乳、肌肉和肝臟中安普霉素的殘留，檢測(cè)時(shí)間相較ELISA 方法縮短20 min，對(duì)牛乳、雞肉和肝臟的檢出限分別為3、3 和10 μg/kg；2016 年，Arduini 等[28]建立了IATC法檢測(cè)葡萄酒中的黃曲霉毒素，整個(gè)程序在10 min 內(nèi)即可完成，檢出限為0.3 μg/L.

本研究基于鏈霉素多克隆抗體，經(jīng)簡(jiǎn)單快速的樣品前處理及反應(yīng)條件優(yōu)化，建立牛奶和肉類中鏈霉素殘留的可視化免疫親和凝膠柱檢測(cè)方法，對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定并與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行方法比對(duì)，其結(jié)果對(duì)實(shí)現(xiàn)牛奶和肉類中鏈霉素高效、現(xiàn)場(chǎng)化的快速篩查具有重要應(yīng)用價(jià)值.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鏈霉素，河北百靈威超精細(xì)材料有限公司；酶標(biāo)二抗（羊抗鼠），中國(guó)上海斯信生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）抗體，北京莊盟生物技術(shù)公司；β-環(huán)糊精，德國(guó)Merck 公司；過(guò)氧化氫脲、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、CNBr-Sepharose 4B 溴化氰活化的瓊脂糖凝膠、Proclin 300 抑菌素，美國(guó)Sigma 公司；二甲基亞砜（DMSO），中國(guó)J＆K 公司；甘氨酸，天津聯(lián)星生物技術(shù)有限公司；NaH2PO4·2H2O，天津金海華興科技發(fā)展有限公司；Na2HPO4·12H2O，天津市大茂化學(xué)試劑廠.

1.2 儀器與設(shè)備

全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Labsystems）、數(shù)顯型酶標(biāo)板振蕩器，美國(guó)IKA 公司；SPE 柱（1 mL）、聚乙烯墊片，美國(guó)Agilent Technologies 公司.

1.3 主要溶液

5 mg/mL 鏈霉素多克隆抗體和5 mg/mL 鏈霉素酶標(biāo)抗原，均由本實(shí)驗(yàn)室合成；偶聯(lián)緩沖液（0.01 mol/L碳酸鈉緩沖液，pH 值=8.3）；封閉緩沖液（10 mL 偶聯(lián)緩沖液加0.3 g 甘氨酸）；平衡淋洗液（0.01 mol/L 乙酸鈉緩沖液，pH 值=4.0）；PBS（0.01 mol/L 磷酸鈉緩沖液，pH 值= 7.4）；PBST（1 L PBS 加0.5 g 吐溫20）；封閉膠（CNBr活化的瓊脂糖凝膠經(jīng)由甘氨酸封閉獲得）；抗體膠（將500 μL STR 抗體固化在CNBr 活化的瓊脂糖凝膠上）；HRP 抗體膠（將10μL 的1mg/mLHRP 抗體固化在CNBr 活化的瓊脂糖凝膠上）.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

利用IATC 法將鏈霉素抗體和辣根過(guò)氧化物酶抗體分別固化在溴化氰活化的瓊脂糖凝膠上形成檢測(cè)層和質(zhì)控層，然后同時(shí)加入待測(cè)樣品液和酶標(biāo)抗原.在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，鏈霉素會(huì)被特異性地結(jié)合到檢測(cè)層，與酶標(biāo)抗原產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)；剩下未與檢測(cè)層結(jié)合的酶標(biāo)抗原與對(duì)照層的HRP 抗體結(jié)合，最后加入底物后根據(jù)檢測(cè)層顏色變化情況確定檢測(cè)結(jié)果.當(dāng)檢測(cè)樣品中的鏈霉素達(dá)到一定濃度的，可使凝膠柱檢測(cè)層的顏色消失，對(duì)照層可作為判斷凝膠柱是否有效的參照，若不顯色則說(shuō)明柱子失效.可視化凝膠柱檢測(cè)鏈霉素方法的具體原理如圖1 所示.

圖1 可視化凝膠柱檢測(cè)鏈霉素方法的原理Fig.1 Schematic diagram of the detection of streptomycin by the visual gel column method

1.4.1 凝膠柱的制備

免疫親和凝膠柱主要由下層的檢測(cè)層和上層的質(zhì)控層組成：質(zhì)控層由最底部的墊片、150 μL 抗HRP抗體膠和封閉膠的混合物及第2 個(gè)墊片組成：檢測(cè)層由第3 個(gè)墊片、150 μL STR 抗體膠和封閉膠的混合液及第4 個(gè)墊片組成.檢測(cè)層和質(zhì)控層中間留出3 mm的空氣間隔，防止加入底物后試劑遷移造成顯色結(jié)果誤差.

1.4.2 檢測(cè)步驟和檢測(cè)條件的優(yōu)化

首先用0.5 mL PBS 分別稀釋酶標(biāo)抗原與STR 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，預(yù)混合后從進(jìn)樣口加入到柱子中.然后用3 mL PBST 和2 mL PBS 分別沖洗柱子，以去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗原和標(biāo)準(zhǔn)品.最后加入300 μL 底物液，反應(yīng)后排出，繼續(xù)反應(yīng)后，觀察顯色結(jié)果.以目測(cè)檢測(cè)層藍(lán)色消失時(shí)STR 的最小濃度定義為凝膠柱的檢出限.

為了縮短檢測(cè)時(shí)間和提高靈敏度，需要進(jìn)行抗體特異性評(píng)估，并且對(duì)STR 抗體膠和HRP 抗體膠的稀釋倍數(shù)（STR 抗體膠分別稀釋5、10、25、50 倍：HRP 抗體膠分別稀釋10、50、100、200、300 倍）、酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)（酶標(biāo)抗原分別稀釋5 000、10 000、20 000 倍）、緩沖液pH 值（設(shè)置緩沖液pH 值分別為5.5、7.4、8.5）、反應(yīng)時(shí)間（設(shè)置反應(yīng)時(shí)間分別為0.5、1、2、3、5 min）和顯色時(shí)間（設(shè)置顯色時(shí)間分別為0.5、1、2、3、5 min）進(jìn)行優(yōu)化，從而達(dá)到快速可視化檢測(cè)的目的.整個(gè)反應(yīng)在室溫條件下進(jìn)行.

1.4.3 樣品的準(zhǔn)備與處理

牛奶樣品：取5 mL 牛奶樣品于10 mL 離心管中，8 000 r/min 離心10 min，取中清液用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至4.6，震蕩混勻后5 000 r/min 離心5 min，取上清液.處理后的樣品液體儲(chǔ)存于棕色小瓶中，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫镁彌_液稀釋即可進(jìn)行檢測(cè).

肉類樣品：取1 g 肉類組織樣品切碎置于10 mL離心管中，加入2 mL PBS（pH 值=7.4），渦旋5 min后5 000 r/min 離心5 min.取上清液，加入2 mL 正己烷充分震蕩后靜置5 min，取下層液體加入2 mL 5%的三氯乙酸溶液，震蕩后5 000 r/min 離心5 min，取上清液.處理后的樣品液體儲(chǔ)存于棕色小瓶中，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫镁彌_液稀釋即可進(jìn)行檢測(cè).

所有樣品均購(gòu)買于天津當(dāng)?shù)厥袌?chǎng).

1.4.4 與HPLC-MS 和ELISA 試劑盒的比對(duì)實(shí)驗(yàn)

取牛奶、牛肉、豬肉共12 件空白樣品，編號(hào)1#～12#，添加鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品制成盲樣用于IATC 和HPLCMS 檢測(cè). HPLC-MS 檢測(cè)條件及方法參考標(biāo)準(zhǔn)方法GBT22945-2008[29].試劑盒選用Beacon 商業(yè)鏈霉素競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒.

樣品用1.4.3 方法處理后接入Oasis HLB 萃取柱配置羧酸型固相萃取柱，待樣品全部通過(guò)后分別用10 mL 水和10 mL 20%的甲醇溶液沖洗柱子，棄去液體及Oasis HLB 萃取柱，用2 mL 0.01mol/L 的庚烷磺酸鈉溶液洗脫羧酸型固相萃取柱，得到的樣品洗脫液過(guò)0.22 μm 水系濾膜后即可進(jìn)行檢測(cè).

1.4.5 凝膠穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

一般的免疫親和凝膠在4 ℃下密封保存，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)影響抗體蛋白的活性，從而使抗體抗原結(jié)合反應(yīng)能力下降，或使抗體與凝膠分子分離，顯色程度降低.因此，本研究在4 ℃下密封保存免疫親和凝膠，選取同一批次不同保存時(shí)間的凝膠進(jìn)行比較，觀測(cè)凝膠的穩(wěn)定性.

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)條件的確定

本研究對(duì)IATC 法檢測(cè)STR 的檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化條件為：檢測(cè)層STR 抗體膠和質(zhì)控層HRP 抗體膠分別用封閉膠以1 ∶20 和1 ∶150 的比例稀釋，酶標(biāo)抗原稀釋10 000 倍，緩沖液液pH 值為7.4，樣品反應(yīng)時(shí)間為2 min，顯色時(shí)間為2 ～3 min.在此條件下檢測(cè)層與質(zhì)控層顯現(xiàn)出清晰的藍(lán)色且顏色一致，如圖2所示，可以進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè).

圖2 鏈霉素可視化凝膠柱檢測(cè)條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of the detection conditions for STR by visual gel detection column

2.2 檢出限的確定

可視化免疫親和凝膠柱檢測(cè)STR 的結(jié)果如圖3所示.隨著STR 濃度的升高，凝膠柱檢測(cè)層的顏色從深到淺再到無(wú).當(dāng)STR 濃度達(dá)到10 μg/L 時(shí)，凝膠柱的檢測(cè)層接近無(wú)色，最終確定可視化免疫親和凝膠柱檢測(cè)STR 方法的檢出限為10 μg/L.

圖3 可視化凝膠柱檢測(cè)鏈霉素檢出限的測(cè)定Fig.3 Determination of the detection limit of streptomycin by visual gel column

2.3 抗體特異性的評(píng)估

利用免疫親和凝膠柱對(duì)鏈霉素及雙氫鏈霉素（dihydrostreptomycin）、慶大霉素（gentamicin）、卡那霉素（kanamycin）、氯霉素（chloramphenicol）、硫酸新霉素（neomycin sulfate）和妥布霉素（tobramycin）的交叉反應(yīng)來(lái)評(píng)估鏈霉素抗體的特異性，結(jié)果如圖4 所示.由圖4 可以看出，鏈霉素和雙氫鏈霉素含量為10 μg/kg時(shí)凝膠柱檢測(cè)層顏色消失，其他抗生素藥物含量為10 000 μg/kg 時(shí)，凝膠柱檢測(cè)層仍會(huì)出現(xiàn)明顯的藍(lán)色，表明本研究中的IATC 方法對(duì)鏈霉素和雙氫鏈霉素有良好的特異性，與其他抗生素藥物沒(méi)有交叉反應(yīng).雙氫鏈霉素是鏈霉素的衍生物，與鏈霉素僅相差1 個(gè)基團(tuán)，與鏈霉素有相似的功效，在使用時(shí)常同時(shí)出現(xiàn)，因此可以同時(shí)檢測(cè).

圖4 STR 抗體與其他抗生素藥物的交叉反應(yīng)Fig.4 Cross-reactivity of STR antibody with other veterinary drugs

2.4 樣品的檢測(cè)

利用可視化ITAC 法對(duì)添加了鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品的牛奶、牛肉和豬肉3 種樣品分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5 所示.由圖5 可以看出，當(dāng)牛奶、牛肉和豬肉的鏈霉素含量分別為20、80和80 μg/kg 及以下時(shí)，凝膠柱檢測(cè)層的藍(lán)色與質(zhì)控層一致；當(dāng)添加鏈霉素含量分別達(dá)到40、160、160 μg/kg 時(shí)，凝膠柱檢測(cè)層的藍(lán)色相較質(zhì)控層明顯變淺；當(dāng)添加鏈霉素含量分別達(dá)到80、320、320 μg/kg 時(shí)，凝膠柱檢測(cè)層的藍(lán)色消失.因此，本研究建立的可視化ITAC 方法檢測(cè)牛奶中鏈霉素殘留的樣品檢出限為40 μg/kg，牛肉和豬肉中鏈霉素殘留的樣品檢出限均為160 μg/kg.

圖5 ITAC 法對(duì)3 種添加了鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品的樣品的檢測(cè)Fig.5 Detection of three samples added with streptomycin standard by ITAC method

2.5 可視化IATC 與HPLC-MS 方法和ELISA 試劑盒的比較

取牛奶、牛肉、豬肉共12 件空白樣品，編號(hào)1#～12#，添加鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品制成盲樣用于ITAC 法和HPLC-MS 法檢測(cè)，結(jié)果如表1 所示.由表1 可以看出，IATC 法最終檢測(cè)出含有鏈霉素的樣品共4 件，其中牛奶1 件、牛肉2 件、豬肉1 件，其結(jié)果與HPLC-LS 方法檢測(cè)結(jié)果一致.

表1 實(shí)際樣品中鏈霉素的檢測(cè)Tab.1 Detection of streptomycin in actual samples μg/kg

IATC 只需要1 min 安裝時(shí)間和較短的洗滌過(guò)程，反應(yīng)過(guò)程僅需2 min，顯色過(guò)程只需要2～3 min，結(jié)果是不用任何儀器直接用肉眼判斷.商業(yè)鏈霉素ELISA試劑盒需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)過(guò)程，孵育和洗滌需要75 min，反應(yīng)需要30 min，顯色需要10～15 min，還需要用儀器測(cè)量吸光度值和數(shù)據(jù)分析. IATC 所需的總測(cè)試時(shí)間（大約7 min）遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于使用商業(yè)鏈霉素ELISA 試劑盒所需的測(cè)試時(shí)間（大約120 min）.雖然IATC 方法靈敏度低于商業(yè)鏈霉素ELISA 試劑盒，但也遠(yuǎn)低于我國(guó)及歐盟等各國(guó)所規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn).因此，IATC 方法檢測(cè)牛奶及肉類中鏈霉素的殘留比商業(yè)鏈霉素ELISA 試劑盒更簡(jiǎn)單、更快速，適用于牛奶及肉類中鏈霉素殘留的快速篩查.

2.6 凝膠穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別選取制備當(dāng)天、保存1 個(gè)月、3 個(gè)月、6 個(gè)月的凝膠制柱進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6 所示.由圖6 可以看出，隨著凝膠柱保存時(shí)間的增加，其靈敏度以及條帶信號(hào)顏色都會(huì)有所下降. 當(dāng)凝膠儲(chǔ)存6 個(gè)月時(shí)，凝膠柱檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，檢測(cè)線和質(zhì)控線顏色幾乎消失.因此確定凝膠最長(zhǎng)保存時(shí)間為3 個(gè)月.

圖6 免疫親和凝膠的穩(wěn)定性Fig.6 Stability of immunoaffinity gel

3 結(jié)論

本研究建立了一種可檢測(cè)牛奶及肉類中鏈霉素殘留的可視化免疫凝膠柱方法.該方法的檢出限為10 μg/kg，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需10 min.牛奶和肉類樣品通過(guò)簡(jiǎn)單處理后即可進(jìn)行檢測(cè)，牛奶中鏈霉素的檢出限為40 μg/kg，肉類中鏈霉素的檢出限為160 μg/kg.該方法耗時(shí)短，操作簡(jiǎn)單，對(duì)于實(shí)現(xiàn)牛奶和肉類中鏈霉素殘留的高效、現(xiàn)場(chǎng)化快速篩查具有重要應(yīng)用價(jià)值.