新型冠狀病毒核衣殼蛋白生物信息學(xué)分析

王玉寧，解翠華，王勝男，范瑩瑩，江亞娟，尹強(qiáng)，焦伯延

（濟(jì)寧市疾病預(yù)防控制中心 檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)寧 272000）

0 引言

冠狀病毒（Coronavirus）是廣泛分布于自然界的一類正鏈RNA 病毒，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)可感染人的有人冠狀病毒229E（Human coronavirus 229E，HCoV-229E）、人冠狀病 毒NL63（Human coronavirus NL63，HCoV-NL63）、人冠狀病毒OC43（Human coronavirus OC43，HCoV-OC43）、人冠狀病毒HKU1（Human coronavirus HKU1，HCoVHKU1）、嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒(Severe acute respiratory syndrome coromavirus，SARS-CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)和嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)[1-3]。SARSCoV-2 爆發(fā)以來，嚴(yán)重威脅人民生命健康，是當(dāng)前世界面臨的最重要公共衛(wèi)生問題之一[6]。

SARS-CoV-2 基因組全長約29.9x103bp[7]，含有12 個(gè)開放讀碼框（Open reading frame，ORF），其中N 基因開放讀碼框（Nucleocapsid Open reading frame，N-ORF）編碼的N蛋白是SARS-CoV-2 的結(jié)構(gòu)蛋白，N蛋白是一種具有高度免疫原性的磷蛋白，在病毒合成過程中，N蛋白直接結(jié)合基因組RNA 形成病毒核衣殼，并在SARS-CoV-2 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和組裝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8-9]。此外，N-ORF 和N蛋白特異性抗體是SARS-CoV-2 病原學(xué)檢測和抗體檢測的重要依據(jù)[10-11]，N蛋白是疫苗和藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)[9,11]。

目前對SARS-CoV-2 N蛋白的研究鮮有報(bào)道，N蛋白的功能暫不明了。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測N蛋白的進(jìn)化變異特征、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能、抗原表位等信息，為更深刻的了解N蛋白的生物學(xué)特征和致病特征提供思路，為SARS-CoV-2 的預(yù)防、實(shí)驗(yàn)室診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 N蛋白序列獲取

登陸NCBI 獲取來源于人的新型冠狀病毒N蛋白氨基酸序列（GenBank 號為MT432195.1）。

1.2 理化分析、親疏水性分析和跨膜分析

利用ExPASy 的ProtParam 軟件分析N蛋白的分子式、氨基酸組成等理化性質(zhì)。利用ExPASy 的ProtScale 軟件分析N蛋白的親水性和疏水性；利用TMHMM 軟件分析N蛋白的跨膜區(qū)域。

1.3 磷酸化位點(diǎn)分析和細(xì)胞定位預(yù)測

利用DisPhos 軟件分析N蛋白的磷酸化位點(diǎn)；利用SignalP 軟件分析N蛋白信號肽序列；利用cNLS軟件分析N蛋白的核定位信號；PredictProtein 軟件分析N蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.4 結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用PredictProtein 軟件分析N蛋白的二硫鍵形成；利用sopma 軟件分析N蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用Phyre2 軟件預(yù)測N蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.5 抗原表位預(yù)測

利用NetMHCIIpan 3.2 Server 軟件預(yù)測N蛋白的輔助性T 細(xì)胞抗原表位；利用NetCTL-1.2 Server 預(yù)測N蛋白的的殺傷性T 細(xì)胞抗原表位；利用ABCpred 軟件預(yù)測N蛋白的B 細(xì)胞抗原表位。

1.6 蛋白、核酸結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

利用PredictProtein 軟件預(yù)測N蛋白的DNA 結(jié)合位點(diǎn)、RNA 結(jié)合位點(diǎn)和蛋白結(jié)合位點(diǎn)。利用RPISeq 軟件進(jìn)行N蛋白與SARS-CoV-2 基因組結(jié)合預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 N蛋白進(jìn)化分析

SARS-CoV-2 的N蛋白氨基酸序列與229E、NL63、OC43、HKU1，SARS，MERS-CoV 等可感染人的冠狀病毒的N蛋白氨基酸序列MEGA 進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒N蛋白與SARS 冠狀病毒N蛋白同源性最高，為90.52%。見圖1。

圖1 人冠狀病毒N蛋白進(jìn)化分析

2.2 N蛋白的理化性質(zhì)

N蛋白由419 個(gè)氨基酸組成，共含6351 個(gè)原子，分子式為C1971H3137N607O627S7，相對分子量45625.70x103。419 個(gè)氨基酸中甘氨酸（Gly）、絲氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）、谷氨酰胺（Gln）、蘇氨酸（Thr）、賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）含量較高，分別占氨基酸總數(shù)10.26%、8.83%、8.83%、8.35%、7.64%、7.40%、6.92%（表1）。帶正電荷的精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys）共有60 個(gè)，帶負(fù)電荷的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）共有36 個(gè)，等電點(diǎn)為10.07，不穩(wěn)定系數(shù)為55.09，在哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞體外半衰期為30h。

表1 N蛋白氨基酸組成情況

2.3 N蛋白親水性、疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

N蛋白的親水性氨基酸占66.9%，第371 位的天冬氨酸親水性最強(qiáng)；疏水性氨基酸占33.1%，第220和221 位的丙氨酸和亮氨酸疏水性最強(qiáng)；平均親水系數(shù)是-0.97，結(jié)果表明N蛋白是親水性蛋白質(zhì)。見圖2。此外，經(jīng)TMHMM 軟件對N蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示N蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)。

圖2 N蛋白親/疏水性分析

2.4 N蛋白磷酸化位點(diǎn)及亞細(xì)胞定位分析

N蛋白共含有37 個(gè)絲氨酸、32 個(gè)蘇氨酸、11 個(gè)酪氨酸，其中蘇氨酸和酪氨酸均不能被磷酸化，但是位于180、183、184、186、187、188、190、193、194、197、201、202、206 位的13 個(gè)絲氨酸可以被磷酸化。見圖3。N蛋白無信號肽序列，含有兩個(gè)核定位信號，分別是位于258-268 的PRQKRTATKAY 和位于370-379 的KDKKKKADET，主要分布于細(xì)胞核。

圖3 N蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

2.5 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

N蛋白氨基酸序列中不含有半胱氨酸，無二硫鍵。N蛋白二級結(jié)構(gòu)中α 螺旋占21.24%，延伸鏈占16.71%，β-轉(zhuǎn)角占6.92%，無規(guī)卷曲占55.13%。見圖4。利用Phyre2對N蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，模板序列是PDB 數(shù)據(jù)庫SARS 冠狀病毒d1sska 序列，可信度為100%。見圖5。

圖4 N蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖5 N蛋白三級結(jié)構(gòu)模型預(yù)測

2.6 抗原表位預(yù)測

對N蛋白進(jìn)行抗原表位預(yù)測，結(jié)果顯示，N蛋白有6 個(gè)殺傷性T 細(xì)胞（Killer T cells，CTL）抗原識別表位，即：48-56、78-87、101-112、164-172、295-303、352-360 位氨基酸，其中104-112 位氨基酸抗原性最強(qiáng)。N蛋白有11個(gè)輔助性T細(xì)胞（HelperTcell，Th）抗原表位，即：52-60、64-72、111-119、130-140、157-165、171-179、227-235、268-278、331-338、360-368、392-400 位氨基酸，其中392-400位氨基酸抗原性最強(qiáng)。N蛋白含有10 個(gè)B 細(xì)胞抗原識別表位，即：12-39、58-74、77-106、114-151、182-197、249-264、268-283、289-304、327-342、354-391位氨基酸，其中91-106 位氨基酸抗原性最強(qiáng)。

2.7 結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

對N蛋白進(jìn)行蛋白、DNA、RNA 結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測，結(jié)果顯示N蛋白第87 位氨基酸和107-111 位氨基酸是與其它蛋白相互作用的結(jié)合位點(diǎn)。N蛋白含有豐富的DNA結(jié)合位點(diǎn)，包括6-17、28-45、48-51、69-77、84-101、114-127、144-153、173-211、255-289位氨基酸。N蛋白的35-37、83-98、255-261 和272-277 位氨基酸是RNA 結(jié)合位點(diǎn)。見圖6。因?yàn)镹蛋白是病毒核衣殼蛋白，在病毒組裝過程中結(jié)合基因組5’端RNA[12]，利用RPIseq軟件預(yù)測N蛋白35-98 和255-277 位氨基酸均與SARS-CoV-2 基因5’端1-200核苷酸可以相互結(jié)合。

圖6 N蛋白結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

3 結(jié)論

SARS-CoV-2 感染是目前全世界最關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件，對世界的經(jīng)濟(jì)、交通、文化及人民的生命健康造成重大影響[13]。我國將SARS-CoV-2 感染列為乙類法定傳染病，參照甲類管理[10]。然而SARSCoV-2 的生物學(xué)特征暫不明了，生物信息學(xué)分析N蛋白對于了解病毒的進(jìn)化變異、防治、診斷具有重要意義。

SARS-CoV-2 和SARS 的N蛋白序列高度同源，SARS-CoV-2 和SARS 的N蛋白可能有共同祖先和共同特點(diǎn)[14]。SARS-CoV-2 的N蛋白含有66.9%的親水性氨基酸，是無跨膜結(jié)構(gòu)的親水性蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn)高達(dá)10.07，說明N蛋白帶有大量正電荷，這些正電荷可能參與基因組RNA 和宿主DNA 結(jié)合。N蛋白是SARS-CoV-2 的磷蛋白[15]，經(jīng)預(yù)測含有13 個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，N蛋白的磷酸化可能改變N蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，可能為病毒的在人體內(nèi)的生存、傳播提供優(yōu)勢。

N蛋白含有豐富的Th、CTL 和B 細(xì)胞抗原識別表位，提示N蛋白可能引起宿主復(fù)雜的細(xì)胞免疫和體液免疫[9,16-17]。CTL 免疫能夠引起宿主細(xì)胞的凋亡，參與肺炎的發(fā)生[18]。B 細(xì)胞產(chǎn)生的N蛋白特異性抗體是目前實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)診斷的重要檢測靶點(diǎn)[9,11]。91-106位氨基酸B 細(xì)胞抗原性最強(qiáng)，130-140、268-278、331-338 位氨基酸同時(shí)是Th 和B 細(xì)胞的抗原識別表位，這些氨基酸序列可能適合作為SARS-CoV-2 感染抗體檢測的核心序列。

N蛋白含有兩個(gè)基因組RNA 結(jié)合位點(diǎn)，N端RNA結(jié)合序列（N-terminal RNA-binding domain，NTD）和C 端RNA 結(jié)合序列（C-terminal dimerization domain，CTD)[15]。本研究對N蛋白的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，35-98 和255-277 位氨基酸是N蛋白的RNA 結(jié)合區(qū)域，其可能與基因組RNA的5’端結(jié)合，參與病毒組裝；此外，N蛋白還可能通過結(jié)合小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、微RNA（microRNA，miRNA）和長非編 碼RNA（Long noncoding RNAs，lncRNA）干擾宿主對SARS-CoV-2 抑制[19-20]，提示35-98 和255-277 位氨基酸區(qū)域可能作為抗病毒藥物研究的靶點(diǎn)。此外，N蛋白含有豐富的DNA 結(jié)合位點(diǎn)，可能能夠結(jié)合宿主基因組，干擾宿主細(xì)胞功能。

綜上所述，本研究對SARS-CoV-2 的N蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對N蛋白的深刻了解具有重要意義，為新型冠狀病毒的核酸檢測和抗體檢測提出建議，為抗病毒藥物的研發(fā)提出新的思路。然而本研究僅是生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)確證。