水楊梅根乙酸乙酯提取物對人肝癌Bel7402細(xì)胞凋亡及增殖的影響

王成功，馬春月，張瑜，韓宇，李思佳，楊旭東

（牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

0 引言

中藥水楊梅（Adina rubella Hance）屬于茜草科水團(tuán)花屬，具有清熱利濕、解毒消腫的作用。已有研究表明，水楊梅具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等生物學(xué)功能[1-4]，但未見其抗肝癌作用的報告。本實驗觀察水楊梅根乙酸乙酯提取物（Ethyl acetate extraction from the root of Adina rubella Hance，EARH）對人肝癌Bel7402細(xì)胞體外抑制作用，為進(jìn)一步開發(fā)其抑癌成分及作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

水楊梅全草（牡丹江大藥房），由牡丹江醫(yī)學(xué)院藥物研究中心鑒定；人肝癌Bel7402細(xì)胞株（武漢中美科技有限公司）；MTT試劑（Sigma公司），胰蛋白酶（上海生工）；胎牛血清（Gibco公司）；DOMO（Sigma公司）；Hoechst33258(碧云天生物技術(shù)有限公司)；DEME培養(yǎng)基（Hyclone公司）；引物核苷酸片段（上海生工）。

1.2 主要儀器

PCR儀（德國，Biometra）；熒光顯微鏡（日本，OLYMPUS）；CO2培養(yǎng)箱（日本，SANYO）；凝膠成像儀（美國，BIO-RAD）。

2 實驗方法

2.1 EARH的制備

稱取水楊梅根粉末1kg，用60%乙醇回流提取，提取2次，將提取液合并，離心，取上清，減壓揮發(fā)乙醇，加入適量乙酸乙酯萃取，減壓濃縮干燥得到2.3g EARH。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

在37℃條件下，5%+CO2，Bel7402細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基中。將對數(shù)生長期細(xì)胞分為4組，實驗組：用培養(yǎng)液倍比稀釋的1、2和4mg/mL的EARH。對照組：含人肝癌Bel7402的DEME培養(yǎng)液。

2.3 MTT實驗

取處于對數(shù)生長期Bel7402細(xì)胞，將細(xì)胞懸液密度調(diào)整為1×104個/mL接種于96孔板，每孔接種100μL。按照2.2分別加入相應(yīng)劑量的EARH，每個劑量設(shè)12個平行孔，分別培養(yǎng)12、24和48h后，每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，孵育4h后，吸棄培養(yǎng)液，向每孔中加入DMSO 150μL。酶標(biāo)儀于波長490nm處，測定吸光度值（OD值），將測得的OD值代入公式計算細(xì)胞生長抑制率（inhibition rate，IR）。IR=（對照組OD-實驗組OD）/（對照組OD-空白組OD）×100%。

2.4 Hoechst33258染色實驗檢測細(xì)胞凋亡率

取指數(shù)生長期的Bel7402細(xì)胞，胰蛋白酶消化后收集Bel7402細(xì)胞，用10%胎牛血清的培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液密度調(diào)整為3×105個/mL，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1mL。細(xì)胞于37℃、5%+CO2培養(yǎng)箱中孵育24h后，實驗組加入不同濃度的EARH；對照組加相同體積的DEME培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，離心收集細(xì)胞。檢測細(xì)胞凋亡時，0.5mL固定液甲醇-冰醋酸（3:1），4℃條件下固定，10min后棄固定液，PBS洗2遍，Hoechst33258染色15min，取出蓋玻片蓋在已滴好抗熒光淬滅劑的載玻片上，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并計算細(xì)胞凋亡率。

2.5 RT-PCR測定survivin、p53表達(dá)

Trizol法提取Bel7402細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR引物序列見表1，以β-actin作為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性50s，95℃變性20s，60℃復(fù)性30s，72℃延伸60s，共35個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統(tǒng)分析計算survivin/β-actin和p53/β-actin的灰度比值作相對定量。

表1 RT-PCR實驗的引物序列

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 EARH對Bel7402細(xì)胞增殖的抑制作用

經(jīng)1、2和4mg/mL的EARH分別處理12、24和48h后，EARH對Bel7402細(xì)胞增殖起到一定的抑制作用；MTT實驗發(fā)現(xiàn)，隨著藥物的濃度增加和作用時間的延長，2和4mg/mL對Bel7402細(xì)胞增殖抑制作用顯著增強(qiáng)（P<0.01）（見表2）。由此表明，EARH具有抑制Bel7402細(xì)胞的增殖的作用。

3.2 EARH誘導(dǎo)Bel7402細(xì)胞凋亡情況

Hoechst33258染色實驗結(jié)果顯示：加入不同濃度EARH培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，EARH各劑量組出現(xiàn)藍(lán)色深染細(xì)胞核碎裂的凋亡細(xì)胞。對照組、1、2、4mg/mL EARH組細(xì)胞凋亡率分別為2.67%，7.29%，13.82%、16.83%。與對照組比較，EARH各劑量組細(xì)胞凋亡率顯著提高，比較有顯著性差異（P<0.01）（見圖1、2）。

表2 EARH對Bel7402細(xì)胞增殖的影響（±s,n=6）

表2 EARH對Bel7402細(xì)胞增殖的影響（±s,n=6）

注：與1mg/mL EARH組比較，**P<0.01。

3.3 EARH對Bel7402細(xì)胞中survivin和p53基因表達(dá)影響

與對照組比較，EARH作用于Bel7402細(xì)胞48h后，各劑量EARH組細(xì)胞survivin基因表達(dá)均顯著降低，（P<0.01，P<0.05）；與對照組比較，EARH作用于Bel7402細(xì)胞48h后，各劑量EARH組細(xì)胞p53基因表達(dá)均顯著升高（P<0.01，P<0.05），見表3。

表3 EARH對Bel7402細(xì)胞survivin和p53表達(dá)影響（±s,n=6）

表3 EARH對Bel7402細(xì)胞survivin和p53表達(dá)影響（±s,n=6）

注：與對照組比較，**P<0.01，*P<0.05

圖1 對照組（400×）

圖2 4 mg/mL EARH各劑量組組（400×）

圖3 各組細(xì)胞p53基因表達(dá)

圖4 各組細(xì)胞survivin基因表達(dá)

4 討論

原發(fā)性肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一[5]，治療難度較大，其死亡率僅次于肺癌、胃癌及食管癌，嚴(yán)重威脅人類健康[6]。細(xì)胞凋亡是指基因精密控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，又稱為程序性細(xì)胞死亡（Programed cell death，PCD）。細(xì)胞凋亡的異常與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，凋亡細(xì)胞的減少及細(xì)胞的過度增殖在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的作用。因此，本實驗研究，EARH對Bel7402細(xì)胞是否具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。

Survivin是凋亡抑制蛋白 (inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族中重要的一員，表達(dá)于胚胎、成人的胸腺、生殖腺及腫瘤中。Survivin具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的過度增殖、調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并且抑制細(xì)胞凋亡等作用[7-8]，是目前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的最強(qiáng)抑制因子。通過與蛋白酶caspase-3、caspase-7結(jié)合抑制其活性，從而抑制細(xì)胞凋亡[9]，是腫瘤治療的重要靶基因。已有研究證實，肝癌患者肝臟中survivin呈現(xiàn)高表達(dá)，并與其病理及預(yù)后密切相關(guān)[10]。本研究顯示，EARH可抑制Bel7402細(xì)胞中survivin基因表達(dá)，促進(jìn)Bel7402細(xì)胞凋亡，濃度越大，作用越顯著。p53基因是人體重要的抑癌基因，廣泛存在于機(jī)體細(xì)胞核中，編碼生成的p53蛋白由四條氨基酸鏈構(gòu)成，活化的p53蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合靶基因上，進(jìn)一步增加bax、fas等基因的表達(dá)，降低bcl-2、cdc25A等基因表達(dá)[11]，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，從而抑制腫瘤的生長[12]，是控制腫瘤細(xì)胞存活的關(guān)鍵[13]。

綜上所述，EARH對肝癌Bel7402細(xì)胞增殖具有抑制作用，4mg/mL EARH組抑制作用最顯著，其作用機(jī)制可能是通過降低survivin基因表達(dá)，上調(diào)p53基因表達(dá)，抑制癌Bel7402細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，為EARH治療肝癌的進(jìn)一步開發(fā)提供了實驗依據(jù)。