雷公藤多苷通過Akt/mTOR信號通路對糖尿病腎病小鼠腎損傷的影響

常帥 徐曉琴 相華 孟偉 鄭海燕 張輝 榮景 周洪 夏菊梅

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)為糖尿病(diabetes mellitus，DM)主要慢性并發(fā)癥之一，國際糖尿病聯盟稱，全世界死亡人數中約有10.7%是DM所造成的，目前全世界范圍內患DM的成人數量高達4.25億[1]。2013年國內一項報道顯示，我國成人DM患病率是10.4%，其中20%～40%患者發(fā)生了DN[2]。當前，伴隨人們生活水平的提升，國內DM患者逐漸呈現出年輕化趨勢，臨床對防治DN已刻不容緩。DN病因病機異常復雜，西醫(yī)多進行降壓、降糖等綜合療法，而中醫(yī)由整體出發(fā)，天人合一作為基礎理論，經過中藥的多途徑、多靶點和多部位對全身內分泌代謝進行調節(jié)[3,4]。雷公藤多苷為單味中藥雷公藤的提取物，具有“活血通絡、祛風除濕”等功效[5]，雷公藤多苷對于前期DN患者的臨床療效已得到認可，但關于其治療機制的相關研究筆者所見較少。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)為絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員之一，DN病理改變和PI3K/Akt/mTOR信號通路活性聯系緊密，調控腎小球固有細胞、系膜細胞等增殖與生長，對介導細胞外基質蛋白合成等有重要影響[6,7]。因此，本研究分析雷公藤多苷通過Akt/mTOR信號通路對DN小鼠腎損傷影響，為臨床患者治療提供一些實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 實驗小鼠 選取SPF級C57 BL/6 J小鼠75只，購自北京維通利華實驗動物公司，許可證號：SCXK(京)：2019-31，體重15～25 g，平均(19.20±3.14)g。常規(guī)飼養(yǎng)1周后開始實驗，小鼠分籠飼養(yǎng)，每個籠內5只，室溫維持22℃～26℃，相對濕度55%～65%，晝夜循環(huán)，保持12 h光照，小鼠灌胃、添加飼料及換水均有專人進行。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器 藥物、試劑：雷公藤多苷(江蘇泰州美通制藥公司)，鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，糖化血清蛋白、尿蛋白、血尿素氮及血清肌酐試劑盒(購自南京建生物研究所)，兔抗鼠p-mTOR多克隆抗體、兔抗鼠mTOR多克隆抗體(美國bioworld公司)，兔抗鼠p-Akt多克隆抗體、兔抗鼠Akt多克隆抗體(美國SAB公司)。儀器：冷凍離心機(型號：5430R，德國Eppendof公司)，臺式離心機(型號：TDL-40B，上海安亭科學儀器)，電泳儀(型號：164-5051，美國Bio-Rad公司)，電子天平(型號：AB135-S，瑞士Mettler Toledo公司)，全自動酶標儀(美國Thermo公司)，旋轉蒸發(fā)儀(型號：LY202B，上海亞榮生化儀器廠)。

1.3 方法 按隨機數字表法將小鼠分成5組，分別為對照組、模型組、雷公藤多苷低劑量組、雷公藤多苷中劑量組和雷公藤多苷高劑量組，每組15只。除對照組外，其他4組小鼠制備DN模型，采用高糖高脂飼料(73.8%基礎飼料、10%蛋黃粉、0.2%膽鹽、10%蔗糖、1%膽固醇、5%豬油)喂養(yǎng)4周，將劑量為120 mg/kg的STZ(pH值4.4檸檬酸鈉緩沖液配制)一次性注入小鼠腹腔內，3 d、5 d及7 d后小鼠禁食但不禁水12 h，剪尾檢測其空腹血糖(FBG)含量，同時采集小鼠24 h尿液，若小鼠FBG≥11.0 mmol/L，同時持續(xù)發(fā)生蛋白尿則說明成功造模。造模后第2天起，依據人和動物劑量轉換公式，雷公藤多苷低、中、高劑量組分別灌胃劑量為25 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg的雷公藤多苷懸濁液(10 mg雷公藤多苷溶于1 ml蒸餾水內，配置濃度是10 g/L)，對照組和模型組灌胃等劑量0.9%氯化鈉溶液，5組小鼠均連續(xù)灌胃8周。

1.4 觀察指標 (1)一般狀況：記錄5組小鼠尿量、死亡只數、飲水、飲食、精神情況、皮毛色澤及活動狀況等。(2)小鼠體重、左腎重和相對腎重：末次給藥后，稱取5組小鼠體重，斷頸處死后將左側腎臟切取，放置在0.9%氯化鈉溶液內浸洗、濾紙吸干后精確稱重，計算小鼠相對腎重(KW/BW)。(3)腎臟病理學觀察：小鼠腎臟稱重后緩沖液沖洗，10%甲醛固定，而后行乙醇梯度脫水、透明，石蠟包埋后切片，厚度為4 μm，常規(guī)行HE染色，在光鏡下觀察5組小鼠腎臟組織病理形態(tài)。(4)小鼠生化指標情況：采集小鼠腹腔靜脈血4 ml，Hitachi7060全自動生化分析儀檢測三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量，血糖儀檢測小鼠FBG含量，糖化血清蛋白、總尿蛋白、血清尿素氮和血清肌酐含量檢測均依據試劑盒說明書進行。(5)qRT-PCR檢測5組小鼠腎臟組織mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt mRNA表達：Trizol消化5組小鼠腎臟組織細胞，mTOR上游引物5’-GTAGTATAGTAGTAGTATA-3’，下游引物5’-GATA

CTACTAGTAGTATGT-3’；p-mTOR上游引物5’-GTAT

AGTACTAGTAGTAGA-3’，下游引物5’-GGTAGTAGC

AGTCGTAGTA-3’；Akt上游引物5’-GAGCGTAGCTAG

CTATCAC-3’，下游引物5’-GCATCAGTCAGCTAGCTA

C-3’；p-Akt上游引物5’-GCATGCATCGATCAGTCAG-3’，下游引物5’-GCATCAGTCAGCTAGTCAG-3’；內參β-actin上游引物5’-GTACTAGTCGTAGCAGTAG-3’，下游引物5’-GCTAGTCAGTCAGCTAGCT-3’，擴增片段479 bp。PCR反應條件：92℃ 40 s，55℃ 450 s，74℃ 70 s，循環(huán)40次后取mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt mRNA循環(huán)閾值(Ct)，ΔΔCt(ΔΔCt=Ct目的基因-△Ct內參基因)分析，計算2-ΔΔCt目的基因相對表達量。(6)Western-blot檢測5組小鼠腎臟組織內mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt蛋白表達：常規(guī)提取5組小鼠腎臟組織細胞總蛋白，上樣電泳，80 V電壓，溴酚藍染料至分離膠提高電壓為100 V，分離膠下泳出溴酚藍結束電泳。PVDF膜內進行蛋白質電轉移，30 mA恒流，持續(xù)80 min。5%TBST脫脂奶粉封閉PVDF膜，震蕩50 min。封閉結束后洗膜3次，10 min/次，膜移至雜交袋，置入漂洗液稀釋抗體，孵育過夜。洗膜3次，10 min/次，置入過氧化物酶標記二抗，震蕩50 min。ECL顯色液中將PVDF膜溫育6 min，依次曝光、顯影、定影。清水沖洗，晾干掃描，IPP軟件對掃描圖像目的條帶行灰度分析。

2 結果

2.1 5組小鼠一般狀況 對照組小鼠無死亡，飲食、飲水及尿量正常，活潑好動，皮毛有光澤；模型組死亡3只，出現明顯多飲多食癥狀，毛發(fā)無光澤、枯槁，活動量明顯下降；雷公藤多苷低、中、高劑量組死亡小鼠分別為2只、2只、1只，小鼠多飲、多食狀況較模型組顯著好轉，毛發(fā)有光澤，活動量較模型組增加。

2.2 5組小鼠體重、左腎重和相對腎重情況比較 模型組小鼠體重較對照組降低，左腎重、相對腎重較對照組升高；雷公藤多苷低、中、高劑量組小鼠體重較模型組升高，左腎重、相對腎重較模型組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 5組小鼠體重、左腎重和相對腎重情況比較

2.3 5組小鼠腎臟病理形態(tài)情況 對照組小鼠腎臟形態(tài)無異常，腎小管、腎小球結構正常，沒有炎性滲出物，髓質與皮質邊界清楚，間質內沒有纖維組織增生；模型組小鼠腎小球系膜細胞增生明顯，有大量的紅細胞滲出，部分腎小管壞死，間質中有淋巴細胞浸潤，部分上皮細胞胞質嗜酸性變強；雷公藤多苷低、中、高劑量組小鼠腎小球系膜細胞增生，少部分腎小管出現壞死、變性，病理受損程度好于模型組。見圖1。

2.4 5組小鼠血脂含量情況比較 模型組小鼠血清TC、TG、LDL含量較對照組升高，HDL含量較對照組降低；雷公藤多苷低、中、高劑量組小鼠血清TC、TG、LDL含量較模型組降低，HDL含量較模型組升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 5組小鼠血脂含量比較

2.5 5組小鼠腎功能指標和血糖情況比較 模型組小鼠血清糖化血清蛋白、尿素氮、肌酐、FBG含量及總尿蛋白較對照組升高；雷公藤多苷低、中、高劑量組小鼠血清蛋白、尿素氮、肌酐、FBG含量及總尿蛋白較模型組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 5組小鼠腎功能和血糖情況比較

2.6 5組小鼠腎臟組織mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt mRNA相對表達量比較 模型組小鼠腎臟組織p-mTOR、p-Akt mRNA相對表達量較對照組升高；雷公藤多苷低、中、高劑量組小鼠腎臟組織p-mTOR、p-Akt mRNA相對表達量較模型組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 5組小鼠腎臟組織mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt mRNA相對表達量比較

2.7 5組小鼠腎臟組織mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt蛋白表達情況比較 模型組小鼠腎臟組織p-mTOR、p-Akt蛋白表達較對照組明顯升高(P<0.05)；雷公藤多苷低、中、高劑量組小鼠腎臟組織p-mTOR、p-Akt蛋白表達較模型組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 5組小鼠腎臟組織mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt蛋白表達情況比較

3 討論

DN的實質為糖尿病腎小球硬化癥，患者前期僅表現是尿微量白蛋白排泄增多，伴隨病情的發(fā)展會進入DN臨床期，表現出水腫、高血壓、大量蛋白尿等癥狀，若不進行及時有效地診療，則可成為終末期腎衰竭，導致機體多器官受損，最終導致患者死亡[8-10]。當前，關于DN發(fā)病機制尚未完全明確，西醫(yī)治療主要為降壓、降糖等對癥療法，無阻斷或者逆轉DN進展的有效措施。

祖國醫(yī)學中沒有關于DN的專名，但依據其臨床表征可歸于“尿濁”、“腎消”、“水腫”等范疇內，其病機在消渴病“燥熱偏盛、陰津虧耗”基礎上，由于燥熱而耗氣傷津，導致氣陰兩虛，而陰損及陽，患者陰陽俱損。正虛之處，乃容邪之所，機體內病理產物痰濕、血淤及氣滯等互相膠結，在腎之脈絡聚集，導致腎氣不固，而精微外泄。當前，多數學者認為DN主要病機為“瘀阻腎絡”，張永杰等[11]認為DN病理特征是瘀阻脈絡，造成氣機受阻，臟腑受損；潘滿立等[12]認為DN患者長時間造成血行不順暢，腎絡受阻而成瘀。雷公藤多苷為單味中藥雷公藤的提取物，具有“活血通絡、祛風除濕”等功效?，F代藥理顯示，雷公藤多苷可對腎臟內巨噬細胞的活化和浸潤抑制，還可抑制VEGF mRNA表達，降低血清炎性因子含量，對系膜細胞系膜基質增殖抑制，進而起到腎臟保護作用[13,14]。

機體內處于高血糖條件，可形成過量結構更穩(wěn)定終末期糖基化產物，結合終末期糖基化產物受體RAGE可導致一系列狀態(tài)異常生命反應進程，還可加速系膜細胞和基底膜細胞的肥大與增殖，隨著體內炎癥損害程度加重，可使終末期腎衰竭進程加快[15-17]。本研究顯示，模型組小鼠血清糖化血清蛋白、尿素氮、肌酐、FBG含量及總尿蛋白較對照組升高；雷公藤多苷低、中、高劑量組小鼠血清蛋白、尿素氮、肌酐、FBG含量及總尿蛋白較模型組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明雷公藤多苷可有效改善DN大鼠腎功能和腎臟的病理狀態(tài)。

mTOR產生了2個功能與結構都不相同蛋白復合物，分別是mTORC1與mTORC2，在Akt/mTOR信號路徑轉導中主要是mTORC1參加，同時發(fā)揮了重要影響[18]。機體內能量水平、營養(yǎng)物質及胰島素等各類生長因子等信號出現改變以后，mTORC1能夠加速下游4E-BP1、S6K1磷酸化，從而對能量代謝、mRNA翻譯、細胞周期進展和蛋白質合成等進行調節(jié)，在細胞分化、生長和增殖等進程中有關鍵性作用。mTOR位于PI3K/PKB下游，所以構成了PI3K/PKB/mTOR路徑，PKB為反轉錄病毒Akt-8內V-akt編碼蛋白產物，因此還可稱為Akt。不同細胞因子影響下，活化PI3K后可形成三位磷酸化磷脂產物導致Akt和膜結合，在PDK影響下，PKB內絲氨酸殘基與蘇氨酸出現磷酸化而進入到胞核與胞質內，經結節(jié)性硬化復合體(TSC)將mTOR蛋白激活，對下游的效應分子4E-BP1與S6K1表達調節(jié)，從而調節(jié)細胞周期改變和細胞的增殖與生長。在高糖影響下，激活了腎臟內細胞表型PI3K/Akt、mTOR信號路徑，導致外基質積聚、系膜細胞肥大增殖和血管平滑肌增殖，加速DN病情發(fā)展。本文研究顯示，模型組小鼠腎臟組織p-mTOR、p-Akt蛋白與mRNA表達較對照組升高；雷公藤多苷低、中、高劑量組小鼠腎臟組織p-mTOR、p-Akt蛋白與mRNA表達較模型組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明雷公藤多苷可抑制DN小鼠Akt/mTOR信號通路活化。

綜上所述，雷公藤多苷可有效改善糖尿病腎病小鼠腎損傷情況，其作用機制可能和抑制Akt/mTOR信號通路活化有關。