乳酸桿菌抑制致病菌及生物保鮮發(fā)酵劑特性評價

徐顯睿，李翠鳳，張宗博，夏文洋，隋勇軍，李道河，陳政言，張?zhí)m威*

（1.青島根源生物技術(shù)集團有限公司食品實驗室，山東 青島 266000；2.青島諾和諾康實業(yè)有限公司，山東 青島 266000；3.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266000）

乳酸桿菌是人體腸道優(yōu)勢益生菌群，具有維持腸道菌群平衡[1]、提高免疫力[2]、抑制有害菌生長[3]、預(yù)防致病菌引起的腸道疾病[4]等功能，對促進腸道和宿主健康有重要作用[5]。乳酸桿菌定植于腸道上皮細胞，代謝過程中產(chǎn)生有機酸、過氧化氫以及多糖、抗菌肽、細菌素等蛋白類抑菌物質(zhì)[6-7]。有機酸可降低腸道pH值、過氧化氫的積累抑制致病菌生長，而蛋白類抑菌物質(zhì)可直接殺滅致病菌。田芬等[8]研究表明，3 株乳雙歧桿菌和2 株嗜酸乳桿菌對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌均有抑制作用；孫群等[9]發(fā)現(xiàn)，副干酪乳桿菌X11、K14對腐敗熒光假單胞菌有很好抑制效果，經(jīng)分析抑菌代謝物均為有機酸。傅容輝等[10]研究表明，5 株乳酸桿菌代謝產(chǎn)生細菌素等蛋白類物質(zhì)和有機酸，對金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌和熒光假單胞菌均表現(xiàn)出良好抑制作用。此外有研究表明，乳酸桿菌黏附性也可抑制腸道致病菌[11]。

由于乳酸桿菌抑菌性具有單菌株特異性[12]，且低溫酸乳、風(fēng)味發(fā)酵乳、乳酸菌飲料和干酪等發(fā)酵類乳品是乳酸桿菌產(chǎn)品消費產(chǎn)業(yè)鏈最重要的載體，尤其低溫酸乳和風(fēng)味發(fā)酵乳保持每年20%消費增長，因此將具有抑菌性的乳酸桿菌制成發(fā)酵劑，在防腐保鮮功能基礎(chǔ)上使發(fā)酵劑的發(fā)酵性能適用于多種發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)，具有較好的市場應(yīng)用潛力。本研究中的乳酸桿菌是經(jīng)耐胃腸液、細胞黏附性體外實驗篩選、具有優(yōu)良潛在益生效果的食品菌株[13]，通過抑制腸道致病菌作用評價各菌株抑菌效果，再經(jīng)單菌株凝乳及產(chǎn)酸性能測試，篩選同時具有優(yōu)良發(fā)酵和抑菌性能的菌株與嗜熱鏈球菌ST-21制備組合生物保鮮發(fā)酵劑，評價各發(fā)酵劑特性，旨在為制備的生物保鮮發(fā)酵劑在發(fā)酵乳制品中的商業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

15 株可用于食品中的乳酸桿菌（分別為Z-41、Z-5、Z-12、Z-15、Z-38、Z-39、Z-1、Z-8、Z-7、Z-17、Z-45、Z-46、Z-16、Z-40、Z-43）、嗜熱鏈球菌ST-21、5 株指示菌株（單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌） 青島根源生物技術(shù)集團有限公司；動物雙歧桿菌乳亞種BB-12美國杜邦公司。

MRS肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份公司；瓊脂北京索萊寶科技有限公司；TSA-YE培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50SⅡ立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；AG050厭氧培養(yǎng)罐 廣州雷得生物技術(shù)有限公司；SE6001FZH電子天平 美國奧豪斯公司；1-7離心機 德國Sigma公司；PHS-3C pH計上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MX-S旋渦振蕩器 美國賽洛捷克公司；756PC紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；iCinac乳品發(fā)酵檢測儀 法國AMS Alliance公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

乳酸桿菌活化：將供試乳酸桿菌菌株按體積分數(shù)2%接種量接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中進行活化（雙歧桿菌屬添加0.1%L-半胱氨酸鹽酸鹽），經(jīng)2 次傳代，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)（雙歧桿菌屬厭氧培養(yǎng)）24 h后待用。

指示菌活化：將指示菌以體積分數(shù)2%接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中（單核細胞增生李斯特氏菌接種到TSA-YE培養(yǎng)基），37 ℃培養(yǎng)24 h，活化2 代后用于后續(xù)實驗。

1.3.2 無細胞抑菌活性上清液制備

將乳酸桿菌接種到液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，于4 ℃、8 000×g離心10 min，取上清液，用0.22 μm濾膜去除菌體和其他雜質(zhì)后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 乳酸桿菌抑菌能力測定及排除有機酸實驗

將指示菌稀釋至107CFU/mL，用移液槍取0.1 mL菌懸液接種到相應(yīng)指示菌固體培養(yǎng)基中，混勻后用無菌涂布器涂至均勻。將3 個無菌的牛津杯均勻放置在培養(yǎng)皿中，取1.3.2節(jié)上清液0.2 mL注入牛津杯中（排除有機酸實驗需用1 mol/L NaOH將1.3.2節(jié)上清液pH值調(diào)整至6.0），在4 ℃冰箱中擴散2 h后37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并用游標卡尺測量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑大小評價抑菌能力。

1.3.4 乳酸桿菌凝乳及產(chǎn)酸性能測試

將1.3.3節(jié)乳酸桿菌接種到質(zhì)量濃度12 g/100 mL滅菌脫脂乳中，按2%接種量發(fā)酵5 代，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)48 h，初步篩選出凝乳狀態(tài)穩(wěn)定的菌株。再將上述菌株按2%接種量接種到12 g/100 mL滅菌脫脂乳中，37 ℃發(fā)酵，采用乳品發(fā)酵檢測儀測定發(fā)酵48 h內(nèi)的pH值。

1.3.5 生物保鮮發(fā)酵劑產(chǎn)酸性能測試

表 1 組合菌種制備生物保鮮發(fā)酵劑配方Table 1 Formulation of bio-preservative starter cultures

將嗜熱鏈球菌S-21與上述篩選出具有抑菌和優(yōu)良產(chǎn)酸性能的乳酸桿菌組合制備生物保鮮發(fā)酵劑，按表1配方以3%接種量接種于滅菌脫脂復(fù)原乳中，于43 ℃發(fā)酵48 h，采用乳品發(fā)酵檢測儀連續(xù)測定pH值。

1.3.6 生物保鮮發(fā)酵劑發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)測定

采用生物保鮮發(fā)酵劑在43 ℃發(fā)酵復(fù)原乳，當pH值至4.55左右時于4 ℃放置48 h，采用TAX-XT2i質(zhì)構(gòu)分析儀測定產(chǎn)品硬度、稠度和黏聚性。測定條件：選用A/BE探頭，壓力盤直徑35 mm。設(shè)置參數(shù)：下降速率1.0 mm/s，測試速率1.0 mm/s，上升速率10.0 mm/s，測試深度30 mm，記錄整個過程中所需應(yīng)力。探入過程中的最大峰值為硬度（g），探頭上行的負峰值為黏聚性（g），曲線正峰面積為稠度（g·s）。

1.3.7 生物保鮮發(fā)酵劑發(fā)酵乳感官評價

采用生物保鮮發(fā)酵劑在43 ℃發(fā)酵復(fù)原乳，當pH值至4.55左右時于4 ℃放置48 h，選擇10 名具有感官評定經(jīng)驗的食品專業(yè)人員進行評分，感官評價標準如表2所示。

表 2 發(fā)酵乳感官評價標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of fermented milk

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸桿菌對腸道致病菌抑制作用實驗結(jié)果

由表3可知，菌株Z-41、Z-12、Z-38、Z-17、Z-45、Z-46、Z-16、Z-40和Z-43共9 株菌對5 株指示菌均有抑制效果，其中菌株Z-17對單核細胞增生李斯特氏菌抑菌效果最好，Z-12對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌抑菌效果最好，Z-38對腸炎沙門氏菌和大腸桿菌抑菌效果較好。除單核細胞增生李斯特氏菌外，菌株Z-5、Z-7對其余4 株指示菌均有抑菌效果，并且2 株菌對大腸桿菌抑菌效果也較好，抑菌圈直徑分別為17.76、13.40 mm。菌株Z-8對腸炎沙門氏菌和大腸桿菌有抑制效果，Z-1和Z-15對大腸桿菌有抑制效果，但上述乳酸桿菌抑菌能力均明顯高于動物雙歧桿菌乳亞種BB-12（僅對大腸桿菌有抑制作用，抑菌圈直徑為11.37 mm）。

表 3 乳酸桿菌抑菌作用結(jié)果Table 3 Antagonistic effect of Lactobacillus strains against pathogens

此外，實驗結(jié)果還表明，上述乳酸桿菌排酸上清液對5 株指示菌均沒有抑制效果，說明本研究中的乳酸桿菌對5 株指示菌產(chǎn)生抑菌效果的主要物質(zhì)是有機酸類。Saleh等[16]研究表明，動物雙歧桿菌乳亞種BB-12對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌有明顯抑制作用，對單核細胞增生李斯特氏菌無抑制作用，與本研究結(jié)果不一致，可能與致病菌菌株特異性或動物雙歧桿菌乳亞種BB-12經(jīng)分離、活化傳代導(dǎo)致性狀突變有關(guān)。

2.2 乳酸桿菌凝乳及產(chǎn)酸性能測試結(jié)果

乳酸桿菌利用乳中乳糖生長代謝產(chǎn)生乳酸，降低復(fù)原乳的pH值，使酪蛋白達到等電點，進而使復(fù)原乳完全凝固，并且菌株在傳代過程中，由于DNA復(fù)制基因存在突變，因此為使菌株發(fā)酵特性穩(wěn)定，對菌株進行傳代并分別評價其凝乳性能。

表 4 乳酸桿菌凝乳性能測試結(jié)果Table 4 Milk curding ability of 15Lactobacillus strains

圖 1 乳酸桿菌產(chǎn)酸性能測試結(jié)果Fig. 1 Acid production ability of Lactobacillus strains

由表4可知，15 株乳酸桿菌的凝乳能力不同。菌株Z-41、Z-5、Z-15、Z-39、Z-1、Z-16在乳中48 h內(nèi)基本不生長，而菌株Z-17則表現(xiàn)為凝乳狀態(tài)不穩(wěn)定，經(jīng)2 次傳代后凝乳能力消失。菌株Z-12、Z-38、Z-8、Z-7、Z-45、Z-46、Z-40、Z-43凝乳狀態(tài)穩(wěn)定，其中菌株Z-43凝乳狀態(tài)一般，其他菌株凝乳狀態(tài)較好。因此為保證制備的生物保鮮發(fā)酵劑能適合多種酸乳制品發(fā)酵、生產(chǎn)的要求，測定上述凝乳狀態(tài)穩(wěn)定的8 株乳酸桿菌發(fā)酵48 h的產(chǎn)酸速率，評價產(chǎn)酸性能。由圖1可知，8 株乳酸桿菌在發(fā)酵48 h的產(chǎn)酸趨勢基本一致。菌株Z-46、Z-7產(chǎn)酸速率較快，發(fā)酵24 h使復(fù)原乳pH值降至4.4左右，此時其他菌株的發(fā)酵復(fù)原乳pH值為4.6～5.0，基本使復(fù)原乳凝固。此外，在脫脂復(fù)原乳pH值至4.5左右時，8 株乳酸桿菌仍具有較快的產(chǎn)酸速率，后酸化水平均較差，其中菌株Z-7發(fā)酵終止時pH值為3.75，其余7 株菌株發(fā)酵終止時pH值在4.0左右，基本相同。因此從乳酸桿菌抑菌效果、凝乳狀態(tài)及穩(wěn)定性、產(chǎn)酸速率綜合考慮，選擇菌株Z-12、Z-38、Z-40、Z-46共4 株乳酸桿菌與嗜熱鏈球菌ST-21進行組合，制備生物保鮮發(fā)酵劑。

2.3 生物保鮮發(fā)酵劑產(chǎn)酸性能測試結(jié)果

圖 2 生物保鮮發(fā)酵劑產(chǎn)酸性能測試結(jié)果Fig. 2 Acid production ability of eight bio-preservative starter cultures

由圖2可知，各發(fā)酵劑配方產(chǎn)酸趨勢基本一致。配方3、7、8產(chǎn)酸速率最快，發(fā)酵5 h時pH值達到4.6左右；配方2產(chǎn)酸最慢，其他配方產(chǎn)酸速率一般，所有配方后酸化水平相對較好。因此，從產(chǎn)酸指標考慮，配方3、7、8適合生產(chǎn)風(fēng)味發(fā)酵乳和乳酸菌飲料，但需同時考慮質(zhì)構(gòu)和感官特性，產(chǎn)酸快，后酸化平緩可縮短發(fā)酵時間，保持產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。Fox等[17]研究表明，產(chǎn)酸過快易導(dǎo)致干酪凝塊破碎，而產(chǎn)酸過慢則使凝塊彈性不足，在上述發(fā)酵劑中配方2產(chǎn)酸最慢，但與李星科[18]、周海珍[19]等篩選干酪發(fā)酵劑的產(chǎn)酸速率基本一致，而且用于制作干酪的發(fā)酵劑主要為乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳脂明串珠菌等嗜溫發(fā)酵劑，產(chǎn)酸速率一般，或嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌等嗜熱發(fā)酵劑，產(chǎn)酸速率較快，但嗜熱型干酪發(fā)酵劑主要為單菌種發(fā)酵[20-21]。此外，現(xiàn)代干酪生產(chǎn)主要采用混合菌種發(fā)酵，減少噬菌體危害程度[22]，且近年多以嗜熱鏈球菌與中溫菌混合發(fā)酵制備切達干酪[23]，因此從菌種組成和產(chǎn)酸性能分析，配方2可作為嗜溫型干酪發(fā)酵劑。

2.4 生物保鮮發(fā)酵劑發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)測定結(jié)果

表 5 不同生物保鮮發(fā)酵劑發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性Table 5 Texture properties of yogurt fermented by eight different bio-preservative starter cultures

由表5可知，后熟48 h不同生物保鮮發(fā)酵劑發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)不同。發(fā)酵乳硬度、稠度和黏聚性基本呈正向關(guān)，且與pH值有關(guān)[24]。配方7、8發(fā)酵乳在硬度、稠度和黏聚性方面突出主要與單菌株特異性有關(guān)，并且有研究表明，發(fā)酵乳黏稠度高適合生產(chǎn)乳酸菌飲料，可降低乳飲料離心沉淀率[25-26]。但陸延等[27]指出，發(fā)酵乳黏度越大，飲料穩(wěn)定性越差，離心沉淀率越高，與上述理論和實際生產(chǎn)相矛盾，這可能是由于高黏度發(fā)酵劑產(chǎn)胞外多糖較多，與酪蛋白結(jié)合使飲料粒徑增大，加快沉降速率，同時和僅添加大豆多糖并不適合構(gòu)建殺菌型乳飲料穩(wěn)定體系有關(guān)。配方2發(fā)酵乳的黏稠度小，有利于干酪中乳清的處理，適合用于干酪發(fā)酵劑[28]。此外其他配方質(zhì)構(gòu)差異無規(guī)律，可能與乳酸桿菌菌株特異性和接種量有關(guān)。乳酸桿菌接種量增加，共生作用使產(chǎn)酸加快，pH值降低，發(fā)酵乳硬度增加；但嗜熱鏈球菌ST-21接種量降低，可能影響胞外多糖的產(chǎn)生，使發(fā)酵乳黏稠度下降[29]。

2.5 生物保鮮發(fā)酵劑發(fā)酵乳感官評價結(jié)果

由表6可知，發(fā)酵乳后熟48 h后在組織狀態(tài)、風(fēng)味和口感方面沒有顯著差異，表現(xiàn)均較好，其中配方3發(fā)酵乳風(fēng)味較突出，配方7、8發(fā)酵乳在組織狀態(tài)和口感方面表現(xiàn)較好，可能均與Z-38、Z-40菌株特異性有關(guān)，而配方2發(fā)酵乳在風(fēng)味和口感上表現(xiàn)一般，可能與菌株Z-12蛋白水解能力有關(guān)。蛋白質(zhì)水解是成熟干酪在后熟中風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)形成最重要的反應(yīng)，由于干酪成熟期一般在6 個月以上，蛋白水解度大的菌株可能產(chǎn)生苦味多肽類物質(zhì)，而由于風(fēng)味發(fā)酵乳貨架期較短，蛋白分解產(chǎn)生的短肽和氨基酸對產(chǎn)品流通期間的風(fēng)味不易產(chǎn)生不良影響[30]，這可能也解釋了配方3適宜制作風(fēng)味發(fā)酵乳，配方2可用于制作干酪。

表 6 不同生物保鮮發(fā)酵劑發(fā)酵乳的感官評價Table 6 Sensory evaluation of yogurt fermented by eight different bio-preservative starter cultures

3 結(jié) 論

對15 株乳酸桿菌進行抑菌、凝乳、產(chǎn)酸實驗，篩選得到Z-12、Z-38、Z-40和Z-46 4 株乳酸桿菌對單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌有明顯抑制效果，且表現(xiàn)出良好的凝乳和產(chǎn)酸性能。將上述4 株乳酸桿菌分別與嗜熱鏈球菌ST-21按不同比例組合制備生物保鮮發(fā)酵劑，測試發(fā)酵劑產(chǎn)酸和質(zhì)構(gòu)特性，并對發(fā)酵乳進行感官評價，其中發(fā)酵劑配方3在發(fā)酵5 h使發(fā)酵乳pH值降至4.6，后酸平緩，具有奶油香氣，適用于生產(chǎn)風(fēng)味發(fā)酵乳。用發(fā)酵劑配方7制備的發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性最好（硬度117.31 g、稠度2 846.18 g·s、黏聚性-77.87 g），適用于生產(chǎn)乳飲料。而用發(fā)酵劑配方2制備的發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性最小（硬度78.04 g，稠度1 562.67 g·s，黏聚性-28.31 g），適合生產(chǎn)干酪。