模擬氮沉降對杉木叢枝菌根真菌侵染率和球囊霉素的影響

汪鷂雄,李 全,沈益康,楊 強,張君波,王艷紅,宋新章

浙江農(nóng)林大學(xué),省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室, 杭州 311300

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是土壤中分布最廣泛的一類微生物組分,與農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)關(guān)系密切,能夠與80%的高等植物形成共生關(guān)系[1]。由于AMF的菌絲比宿主植物根系更細且密度更大[1],AMF能夠吸收到宿主植物根部無法觸及的營養(yǎng)物質(zhì)[2-3],能明顯改善宿主植物的營養(yǎng)狀況。而侵染率是AMF與植物共生關(guān)系緊密程度的一個重要標志[4]。球囊霉素在土壤團聚體形成過程中起到了“粘合劑”的功能,能夠提高土壤結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和減慢有機碳的分解速度,提高土壤的肥力從而改善宿主植物營養(yǎng)狀況[5]。另外球囊霉素是由AMF的菌絲體和孢子壁層產(chǎn)生的一種糖蛋白,可產(chǎn)生于根內(nèi)菌絲也可產(chǎn)生于根外菌絲,隨著根系、菌絲和孢子的降解而進入土壤[6],是土壤有機質(zhì)的重要組成部分[7],因此,球囊霉素一定程度上能反映AMF在土壤中的生存狀況。球囊霉素按照提取的難易程度可分為易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白(EE-GRSP)和總球囊霉素相關(guān)土壤蛋白(T-GRSP)[8]。大量研究發(fā)現(xiàn)土地肥力情況、土地利用方式、環(huán)境條件等均會影響AMF侵染率[9]和球囊霉素[10]的含量及分布。其中,施氮肥顯著影響了AMF活性[11]。然而,關(guān)于大氣氮沉降對AMF侵染率和球囊霉素的影響則鮮有報道,氮沉降與施氮肥對AMF的影響是否一致,也還需要進一步的研究。

近年來,由于工業(yè)上化石燃料的持續(xù)燃燒、農(nóng)業(yè)上氮肥的大量施用、以及畜禽養(yǎng)殖方面產(chǎn)生的污染等,氮的排放量持續(xù)增加,大氣中活性氮濃度逐漸升高。大氣氮沉降日益增強,這種趨勢已從發(fā)達地區(qū)迅速擴展到全球范圍,極大影響了全球氮循環(huán)[12]。長期高強度氮沉降輸入森林土壤使有機質(zhì)、pH值、有效磷等呈下降趨勢[13],并且導(dǎo)致硝酸鹽流失[14-15],而這些土壤理化性質(zhì)的改變也可能影響AMF活性。此前關(guān)于三葉草,大豆和洋蔥的研究顯示氮輸入增加會顯著抑制AMF侵染宿主植物[16-17],而Hepper關(guān)于萵苣的研究則與之相反[18],隨著氮增加,AMF侵染率也隨之顯著增加。這些研究更多針對的是草本植物,且大部分是盆栽實驗,而對于野外條件下木本植物與AMF共生關(guān)系的研究則極少,尤其是人工林生態(tài)系統(tǒng)。

杉木(Cunninghamialanceolata)作為我國最重要的森林資源之一,是我國南方栽培最廣的速生樹種之一,杉木木材的銷售收入是南方許多地區(qū)林農(nóng)主要的經(jīng)濟收入來源。一方面由于一些林農(nóng)存在重栽疏養(yǎng)的現(xiàn)象,導(dǎo)致林木材質(zhì)下降,經(jīng)濟效益不佳,林農(nóng)對杉木的種植積極性下降。其次,林農(nóng)為了獲取更高的經(jīng)濟效益,砍伐杉木林轉(zhuǎn)型種植經(jīng)濟價值更高的經(jīng)濟樹種,從而導(dǎo)致杉木林面積減少[19]。因此,提高杉木木材品質(zhì)對于杉木林的可持續(xù)經(jīng)營有著至關(guān)重要的作用。目前,杉木林廣泛種植在我國亞熱帶地區(qū)[20],而該地方也是我國氮沉降最嚴重的地區(qū),有研究表明我國亞熱帶地區(qū)的最大年氮沉降量達到了6.35 g N m-2a-1[21],并且預(yù)計有進一步增加的趨勢[22]。盡管學(xué)者已經(jīng)對杉木進行了大量的有關(guān)氮沉降的研究,比如氮沉降對杉木幼苗的叢枝菌根真菌氮素吸收的影響[23]和氮沉降對杉木林養(yǎng)分分配的影響[24],但氮沉降對野外杉木AMF侵染率和球囊霉素的影響的關(guān)注較少。故本研究以杉木作為研究對象,探究氮沉降對不同季節(jié)AMF侵染率和球囊霉素影響,提出并驗證以下3個假設(shè);(1)氮沉降增加了AMF的侵染率和球囊霉素的含量;(2)季節(jié)會影響杉木AMF的侵染率和球囊霉素的含量;(3)氮沉降和季節(jié)的交互作用會影響杉木AMF的侵染率和球囊霉素含量。以期為氮沉降背景下的杉木林經(jīng)營管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

試驗地(119°67′E,30°21′N)位于浙江省杭州市臨安區(qū)。該區(qū)地處中亞熱帶季風氣候區(qū)的北緣,四季分明,氣候溫和,雨量充沛,年均降水量1420mm左右,年均氣溫15.6 ℃,年均無霜期230d左右,土壤為黃壤,地形地貌為低山丘陵。

1.2 實驗設(shè)計

試驗樣地的杉木林為10年生杉木林,選取樣地內(nèi)9棵長勢相近的杉木,平均樹高約3m,平均樹冠面積約2m×2m。以杉木為中心設(shè)一個3m×3m獨立小樣方,每個樣方四周用0.5m深的鋁塑板隔開,樣方相隔至少2m。模擬氮沉降處理參照國際上氮沉降模擬研究的試驗方法[25-26],依據(jù)我國亞熱帶地區(qū)的實際氮沉降量及未來增加趨勢[27],以當?shù)氐两德?—3.7 g N m-2a-1為基礎(chǔ)[28],設(shè)置2個水平：低氮(N3)為3 g N m-2a-1,高氮(N6)為6 g N m-2a-1。另外設(shè)置對照處理Control。共3個處理,每個處理3個重復(fù),隨機設(shè)置。從2017年4月起至今,每個月噴施1次,每年12次。具體方法為：每月月初將每個樣方所需噴施的一定量的NH4NO3溶解在水中,利用電動噴霧器,從樹冠上方往下均勻噴灑。對照處理樣方噴灑同量水但不添加氮,以避免處理間因外加水而造成的影響。

1.2.1樣品采集

在2019年1月和4月采集土壤和杉木根系樣品。在每個樣方內(nèi),以杉木基部為中心,按東西南北4 個方位,去除枯枝落葉層后,在40cm為長和寬矩形面積內(nèi),0—20 cm 土層深度范圍內(nèi)沿根系采集帶有細根(≤2mm)的根系,用抖土法收集根系表面的土壤將其作為根際土壤[29]。土壤和根系樣品均裝入無菌塑料袋,置于4°C保溫箱中,帶回實驗室。土樣通過篩子(< 2mm)后自然風干,用于球囊霉素和土壤理化性質(zhì)的測定。根系用自來水沖洗,然后用滅菌的超純水沖洗,選取根徑≤2mm的細根,將洗凈的細根剪成1cm的根段,放入提前配好的FAA固定液(38%的福爾馬林、冰醋酸、70%的酒精,三者按照體積比1∶1∶9配置)保存,用于侵染率的測定。

1.2.2AMF侵染率和球囊霉素的測定方法

侵染率的測定先采用改進的酸性品紅染色法染色[30],然后用網(wǎng)格交叉法測定[4]。易提取球囊霉素(EE-GRSP)和總球囊霉素(T-GRSP)的提取和定量分析參考Wright等[31]和Janos等[32]的方法。

1.2.3土壤理化性質(zhì)的測定方法

土壤全氮含量采用H2SO4-H2O2消煮后,半微量凱氏法測定[33]。土壤全磷含量用H2SO4-H2O2消煮后,鉬銻抗比色法測定[34]。土壤有效磷用雙酸法,采用[c(HCl)=0.05mol/L和c(1/2H2SO4)=0.025mol/L]的提取液提取酸溶性磷和吸附態(tài)磷,采用鉬銻抗比色法,使用可見分光光度計進行測定[35]。土壤有效氮采用堿解擴散法,用1mol/L NaOH溶液水解土壤,使易水解態(tài)氮(潛在有效氮)堿解轉(zhuǎn)化為NH3,NH3擴散后為硼酸吸收。硼酸吸收堿解液中的NH3后再用0.01mol/L H2SO4滴定,然后計算土壤中有效氮的含量[36]。土壤pH值,按照水土比為2.5∶1,采用便攜式pH計測定(FE20,Mettler Toledo,Switzerland)[37]。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析,采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)結(jié)合最小顯著差異法(LSD)比較不同氮處理下AMF侵染率、易提取球囊霉素、總球囊霉素含量和土壤有效氮磷比的差異性。采用可重復(fù)雙因素方差分析(General Linear Model;GLM過程,SPSS 17.0)分析氮添加和季節(jié)及其交互作用對杉木林土壤的AMF侵染率、易提取球囊霉素、總球囊霉素和土壤有效氮磷比的影響。采用Pearson相關(guān)性分析土壤理化性質(zhì)與侵染率、易提取球囊霉素和總球囊霉素的相關(guān)性。圖由sigmaplot12.5軟件制作,數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 杉木AMF侵染率

如圖1所示,無論在冬季和春季,與對照相比,N3處理均顯著增加了AMF侵染率,而N6處理無顯著影響。其中,在冬季,N3處理顯著增加了59.71%(P<0.05),在春季,N3處理顯著增加了539.50%(P<0.05)。相同氮沉降處理下,冬季的AMF侵染率均顯著高于春季,分別增加89.27%(Control),57.15%(N3)和67.68%(N6)。雙因素方差分析表明氮沉降和季節(jié)均顯著影響杉木AMF侵染率(表1)。

圖1 不同氮沉降處理對杉木AMF侵染率的影響

2.2 杉木根際土壤易提取球囊霉素含量

如圖2所示,在冬季,與對照相比,N3處理的根際土壤易提取球囊霉素含量無顯著變化(P>0.05),N6處理下的根際土壤易提取球囊霉素含量顯著提高了50.19%(P<0.05)。而在春季,N3相比對照顯著降低了16.80%(P<0.05),N6相比對照顯著降低了9.80%(P<0.05)。相同氮沉降處理下,冬季的易提取球囊霉素均顯著低于春季(P<0.01),分別降低了44.78%(Control),35.55%(N3)和8.02%(N6)。雙因素方差分析表明氮沉降和季節(jié)及其兩者的交互作用均顯著影響杉木根際土壤易提取球囊霉素含量(表1)。

圖2 在不同季節(jié)不同氮沉降處理對杉木根際土壤易提取球囊霉素含量的影響

2.3 杉木根際土壤總球囊霉素含量

如圖3所示,在冬季,氮沉降處理對杉木根際土壤總球囊霉素含量無顯著影響(P>0.05)。在春季,N6處理下的杉木根際土壤總球囊霉素的含量比對照顯著增加了22.26%(P<0.05)。相同氮添加情況下,冬季的杉木根際土壤總球囊霉素顯著低于春季,其中分別降低了58.81%(Control),52.21%(N3),和60.39%(N6)。雙因素方差分析表明氮沉降和季節(jié)及其兩者的交互作用均顯著影響杉木根際土壤總提取球囊霉素含量(表1)。

圖3 在不同季節(jié)不同氮沉降處理對杉木根際土壤總球囊霉素含量的影響

2.4 杉木根際土壤有效氮磷比

如圖4所示,在冬季,氮沉降處理顯著增加杉木根際土壤有效氮磷比(P<0.05)。N3處理的土壤有效氮磷比比對照顯著增加了42.22%(P<0.05)。在春季,氮沉降處理顯著增加杉木根際土壤有效氮磷比(P<0.05)。N3處理的土壤有效氮磷比比對照顯著增加了104.30%(P<0.05)。相同氮添加情況下,冬季的杉木根際土壤有效氮磷比顯著高于春季,其中分別增加了759.95%(Control),498.61%(N3),和477.98%(N6)。雙因素方差分析表明氮沉降和季節(jié)及其兩者的交互作用均顯著影響杉木根際土壤有效氮磷比(表1)。

圖4 在不同季節(jié)不同氮沉降處理對杉木根際土壤有效氮磷比的影響

表1 氮沉降和季節(jié)對杉木AMF侵染率和球囊霉素的雙因素方差分析

2.5 AMF的侵染率、球囊霉素含量和土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

由表2可見,Pearson相關(guān)性分析表明,AMF侵染率與土壤有效磷有極顯著負相關(guān)的關(guān)系(P<0.01),與pH值有極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01),與有效氮磷比有極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。易提取球囊霉素和總球囊霉素含量與土壤有效磷有極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01),與pH值有極顯著負相關(guān)關(guān)系(P<0.01),與有效氮磷比有極顯著負相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。

表2 杉木AMF侵染率,球囊霉素與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

3 討論

3.1 氮沉降對杉木AMF侵染率和球囊霉素的影響

在冬春季節(jié),適當?shù)牡砑?3 g N m-2a-1)顯著提高了AMF侵染率,這與我們的假設(shè)(1)一致。與Johnson等的研究結(jié)果相似[38],其研究表明在草原土壤中,氮添加顯著增加了AMF侵染率。原因可能是氮添加使得植物可以利用的有效氮增加,根系吸收營養(yǎng)物質(zhì)的方式(尤其是磷元素)無法滿足植物自身的氮磷營養(yǎng)平衡,因此通過AMF侵染根系以便獲取土壤中的有效磷[39],從而使得AMF侵染率增加[40]。相關(guān)性分析AMF侵染率與有效氮磷比顯著正相關(guān)。我們的實驗結(jié)果表明氮沉降顯著增加了土壤有效氮磷比,間接支持了上述觀點。在冬季,氮沉降增加易提取球囊霉素含量。Treseder等發(fā)現(xiàn)氮添加會增加AM真菌的侵染率和菌絲長度,這導(dǎo)致土壤中菌絲的生物量增加[41],這些根外菌絲更新或者降解后引起了土壤中易提取球囊霉素的增加[42]。而春季的易提取球囊霉素是受到氮添加的抑制的,原因可能是春季溫度上升,刺激了AMF等土壤微生物的增長。更進一步研究發(fā)現(xiàn),相比真菌,細菌對氮增加的更加敏感,更有利于細菌的增加,從而到導(dǎo)致了真菌細菌比降低[43]。同時易提取球囊霉素不穩(wěn)定,容易被細菌快速分解[44],從而導(dǎo)致易提取球囊霉素含量低。盡管AMF侵染率提高,但在春季仍呈現(xiàn)出氮添加減少了易提取球囊霉素含量的現(xiàn)象。在冬季氮添加增加了總球囊霉素,但是未達到顯著水平,而春季,氮添加顯著增加了總球囊霉素含量。杉木由于氮添加,生長發(fā)育受到有效磷限制,它們可能會傾向于投資一些獲取磷能力更強的AMF類群,比如巨胞囊霉科[45]。而巨胞囊霉科真菌產(chǎn)生的根外菌絲多于球囊霉科真菌[46],增加了根外菌絲的生物量。然而菌絲的降解需要一段時間[47],且總球囊霉素是較為穩(wěn)定的球囊霉素[44],不易被微生物分解,從而直到春季氮添加才顯著提高了總球囊霉素含量。由于球囊霉素是土壤團聚體形成的重要粘合劑,且土壤團聚體形成是影響土壤碳固持和碳穩(wěn)定的重要機制[31]。無論在春季還是冬季,氮沉降均提高了總球囊霉素含量,表明氮沉降有利于土壤團聚體的形成,從而有利于土壤的碳穩(wěn)定?？赡芤馕吨两的軌驕p緩?fù)寥乐刑嫉尼尫?進而減少杉木林溫室氣體的排放。

3.2 季節(jié)變化對杉木AMF侵染率和土壤球囊霉素的影響

在對照處理下,春季的AMF侵染率顯著低于冬季,支持了我們的假設(shè)(2)季節(jié)變化影響了杉木AMF的侵染率。原因可能是相比于冬季,春季溫度上升,微生物活性增強,分解有機物釋放出更多的營養(yǎng)物質(zhì),便于根系的吸收,從而減少了對AMF的依賴,進而導(dǎo)致AMF侵染率下降[48]。此外,侵染率和土壤有效氮磷比呈極顯著正相關(guān),春季土壤的有效氮磷比顯著低于冬季,也支持了上述觀點[49]。在對照處理下,春季的易提取球囊霉素和總球囊霉素含量均顯著高于冬季。原因可能是春季微生物活性增強,土壤中的其他微生物與AMF競爭,AMF獲得的碳源比冬季少,前一個季節(jié)產(chǎn)生的菌絲大量降解,因此春季的球囊霉素含量顯著高于冬季[47]。鑒于球囊霉素在土壤團聚體形成中的獨特作用[31],相比較冬季而言,春季更有助于土壤團聚體的形成,有助于減緩春季土壤碳的釋放,也有助于減少于營養(yǎng)物質(zhì)的淋失[50],從而保障植物養(yǎng)分供應(yīng)。在氮添加處理下,春季的易提取球囊霉素和總球囊霉素含量均顯著高于冬季,這與我們的假設(shè)(3)不一致。表明氮沉降并未改變季節(jié)因素對易提取球囊霉素和總球囊霉素的影響。

4 結(jié)論

在冬春季,氮沉降提高了杉木林AMF侵染率和土壤總球囊霉素含量。表明氮沉降使杉木與AMF的共生關(guān)系更加緊密,植物依賴于AMF吸收更多的養(yǎng)分,從而利于植物在逆境中的生長。在相同氮添加情況下,春季的AMF侵染率顯著低于冬季,而易提取球囊霉素和總球囊霉素含量則顯著高于冬季。這表明隨著季節(jié)的變化,杉木對AMF的依賴度也會隨之變化。在相同氮添加情況下,春季的AMF侵染率顯著低于冬季,而易提取球囊霉素和總球囊霉素含量則顯著高于冬季。表明在兩者交互作用下,氮沉降并未改變季節(jié)因素對杉木與AMF共生關(guān)系的影響。