高效液相色譜法測(cè)定不同殺青工藝咖啡葉茶的主要功能成分

練珊珊，姚思遷，汪艷霞，姚新轉(zhuǎn)，2，呂立堂，2※

（1.貴州大學(xué)茶學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院，2.山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（教育部），貴州貴陽(yáng)550025）

咖啡與茶、可可并稱為當(dāng)今世界的三大飲料，飲用咖啡在歐美國(guó)家很普遍?？Х榷乖谑澜缟蠌V受歡迎，但咖啡樹(shù)葉的價(jià)值反而被長(zhǎng)期忽略[1]?？Х葮?shù)和咖啡食用的起源地公認(rèn)在非洲，具體地區(qū)說(shuō)法不一，但多數(shù)人認(rèn)為在東非的文明古國(guó)埃塞俄比亞[2]。咖啡葉制成的茶在非洲部分地區(qū)食用歷史有5個(gè)世紀(jì)[1]。研究表明，咖啡葉茶中含有大量的粗纖維、兒茶素以及咖啡因等物質(zhì)，其中的抗氧化物含量比咖啡、綠茶和紅茶高出許多，可即刻舒緩饑餓和疲勞感，同時(shí)可使頭腦清醒，提振精神[3]?？Х热~茶中含有豐富的酚類(lèi)化合物，如綠原酸。Nishi等[4]發(fā)現(xiàn)綠原酸可以顯著降低膽固醇，預(yù)防動(dòng)脈硬化等疾病。另外，咖啡葉茶還含有較多的芒果苷，具有抗炎、抗糖尿病、抗高脂血癥、抗氧化，抗微生物和神經(jīng)保護(hù)等作用[5]。比起咖啡和茶，咖啡葉茶不但咖啡因含量低苦味淡、味道溫和，還含有許多有益健康的活性成分[6，7]。前期研究中，有研究人員參照曬青綠茶的加工工藝制備咖啡葉茶[8]，也有以夏季咖啡樹(shù)鮮葉為原料，參照白茶、綠茶、烏龍茶和黑茶工藝研究開(kāi)發(fā)咖啡葉茶[9]。但對(duì)咖啡葉茶制作的工藝參數(shù)、化學(xué)物質(zhì)和品質(zhì)形成機(jī)理等報(bào)道較少。為此，本研究通過(guò)高效液相色譜法（HPLC）、感官審評(píng)試驗(yàn)和自由基清除試驗(yàn)等研究探討了3種殺青工藝的咖啡葉茶，確定了咖啡葉茶加工的可行性，分析比較了成分含量的差異和成因，以期為咖啡葉茶的提質(zhì)加工和咖啡樹(shù)資源的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)，可增加咖啡葉茶在市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力，推動(dòng)咖啡葉茶的加工和銷(xiāo)售。

1 材料與方法

1.1 原料

咖啡（Coffea arabica L.）樹(shù)鮮葉（2019年6月采自貴州省東南部農(nóng)作物農(nóng)場(chǎng)）由兩片葉子和少量芽組成。所有標(biāo)準(zhǔn)品咖啡因（壇墨質(zhì)檢，貨號(hào)：A1905476）、兒茶素（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，貨號(hào)：07420050）、綠原酸（ANPEL，貨號(hào)：L1240025）、葫蘆巴堿（成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：190606）、芒果苷（南京源植生物科技有限公司，批號(hào)：Y2112820）、蘆?。ㄈ缂锟萍脊煞萦邢薰?，貨號(hào)：STA102）純度均大于98%。甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 咖啡葉茶的制備參考常規(guī)綠茶的加工方法:攤晾→殺青→揉捻→干燥4個(gè)步驟。鮮葉攤晾10 cm左右的厚度，室溫28℃攤晾3 h左右，每隔30 min翻動(dòng)1次，直至鮮葉含水量降至70%左右進(jìn)行下一步殺青。采用3種不同的殺青方法：滾筒殺青、微波殺青和蒸汽殺青，具體殺青參數(shù)見(jiàn)表1。殺青至適度，趁熱揉捻，適當(dāng)破壞葉組織，使汁液附著葉面，揉捻時(shí)間20min。揉捻好的咖啡葉放入烘干機(jī)中，在60℃烘30 min，得到3種不同殺青工藝的咖啡葉成品茶。

表1 不同殺青工藝相關(guān)參數(shù)Table 1 Parameters of different fixation technology

1.2.2 感官審評(píng)方法參照GB/T 23776-2009茶葉感官評(píng)價(jià)方法，采用五因素法從外形25%和內(nèi)在品質(zhì)（湯色10%、香氣25%、滋味30%、葉底10%）對(duì)3種咖啡葉茶進(jìn)行感官審評(píng)。按照百分制，由5位專(zhuān)家審評(píng)。

1.2.3 內(nèi)含成分分析使用Shimadzu LC-20AT HPLC分析儀（日本Shimadzu Corporation，日本京都）進(jìn)行高效液相色譜法分析，該色譜儀配備有CTO-10AS VP柱溫箱，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，LC-20AT泵和SPD-20A紫外光譜檢測(cè)儀。使用Agela Technologies Venusil XBP-C18色譜柱（4.6 150 mm，5m）進(jìn)行分離?？Х纫蚝康臋z測(cè)參照食品安全的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB 5009.139-2014）；兒茶素含量的測(cè)定參照食品安全的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB/T8313-2018）；綠原酸含量的測(cè)定參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法（GB/T 22250-2008）；葫蘆巴堿的檢測(cè)參照實(shí)驗(yàn)室已建立的方法[10]；蘆丁的檢測(cè)參照實(shí)驗(yàn)室已建立的方法[11，12]；芒果苷的檢測(cè)參照實(shí)驗(yàn)室已建立的方法[13，14]。將咖啡葉茶磨碎后制備供試品溶液，使其能過(guò)0.45m的微孔濾膜。葫蘆巴堿、蘆丁和芒果苷的供試品溶液前處理方法根據(jù)實(shí)際情況做出以下優(yōu)化，葫蘆巴堿，稱取樣品0.5g于25mL容量瓶中，加50%甲醇適量，浸泡1 h，超聲45 min，定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45m濾膜上機(jī)；蘆丁，稱取0.5g，置于索氏提取器中，用石油醚（60～90℃）提取脂溶性成分，棄去石油醚提取液，剩余物揮去石油醚，再以甲醇加熱回流提取1.5 h并定容，過(guò)0.45m濾膜待用；芒果苷，稱取樣品0.5 g于20 mL容量瓶中，加入稀乙酸18 mL，超聲30 min，放冷后定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45m濾膜待用。

1.2.4 清除自由基活性測(cè)定 用Jelena等[15]開(kāi)發(fā)的方法測(cè)定DPPH清除活性。制備0.2 g/L的DPPH溶液，并用乙醇稀釋至吸光度0.70±0.01。取2 mL的咖啡葉茶浸提液和5 mL稀釋的DPPH溶液混合，在黑暗中放置30 min以徹底反應(yīng)，然后在517 nm處測(cè)量混合物的吸光度，以抗壞血酸作為參照比較效果，計(jì)算樣品的DPPH清除活性為每克樣品干重所對(duì)應(yīng)的抗壞血酸量（mg）。由QUIROGA（2013）[16]和SIGER（2015）[17]開(kāi)發(fā)的方法用于確定ABTS清除活性，將7mmol/L ABTS溶液和4.9 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液等量混合，然后在黑暗中反應(yīng)12 h，然后用乙醇將混合物溶液稀釋至吸光度為0.70±0.01，取2 mL樣品提取物和5 mL稀釋的ABTS溶液混合，在黑暗中反應(yīng)7 min，然后在734 nm處測(cè)量混合物的吸光度，以抗壞血酸作為參照比較效果，計(jì)算樣品的DPPH清除活性為每克樣品干重所對(duì)應(yīng)的抗壞血酸量（mg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺青方式對(duì)咖啡葉茶感官品質(zhì)的影響

3種咖啡葉茶樣品經(jīng)感官審評(píng)，結(jié)果見(jiàn)表2?？Х热~制成的飲品茶氣味清香，滾筒殺青的咖啡葉茶不但香氣更為清香純正，而且滋味口感也比微波咖啡葉茶和蒸汽殺青茶更為醇正濃厚。但微波殺青的咖啡葉受熱均勻迅速，在外形色澤上比起滾筒殺青咖啡茶和蒸汽殺青咖啡茶更為完整明亮。滾筒殺青咖啡葉受蒸汽殺青后更為濕潤(rùn)，揉捻時(shí)葉邊緣略有破損，外形和葉底評(píng)分低于微波殺青。就綜合評(píng)分可以看出，滾筒殺青88.95＞微波殺青87.35＞蒸汽殺青86.20，說(shuō)明咖啡樹(shù)葉的加工可以在傳統(tǒng)綠茶工藝中的殺青環(huán)節(jié)里采用滾筒和微波殺青，以得到滋味、香氣、品質(zhì)和外形色澤更優(yōu)的咖啡葉茶。

表2 不同殺青方法對(duì)咖啡葉茶感官品質(zhì)的影響Table 2 Results of different fixation methods on sensory quality of coffee leaves tea 單位：%

2.2 殺青方式對(duì)咖啡葉茶功能成分的影響

在不同的預(yù)處理方法和色譜條件下，通過(guò)HPLC檢測(cè)微波、蒸汽和滾筒3種不同殺青工藝制成的咖啡葉茶。如圖1所示，在278 nm、272 nm、257 nm、258 nm、265 nm和327 nm處的波長(zhǎng)下檢測(cè)到兒茶素、咖啡堿、蘆丁、芒果苷、葫蘆巴堿和綠原酸標(biāo)品，且色譜圖的峰響應(yīng)高，基線穩(wěn)定，峰形良好。以峰面積為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程和色譜峰面積計(jì)算求得各物質(zhì)的含量。結(jié)果見(jiàn)表3，重復(fù)3次，取平均值。咖啡堿的含量為滾筒殺青（6.71±0.27）mg/g、微波殺青（6.74±0.16）mg/g、蒸汽殺青（6.86±0.89）mg/g。葫蘆巴堿含量為：滾筒殺青（4.55±0.14）mg/g、微波殺青（4.73±0.25）mg/g、蒸汽殺青（4.75±0.29）mg/g。蘆丁含量為滾筒殺青（0.033±0.003）mg/g、微波殺青（0.028±0.005）mg/g、蒸汽殺青（0.025±0.002）mg/g。兒茶素的含量為滾筒殺青（21.8±0.75）mg/g、微波殺青（23.5±0.48）mg/g、蒸汽殺青（22.9±0.53）mg/g。綠原酸的含量為滾筒殺青（39.5±0.61）mg/g、微波殺青（35.1±0.38）mg/g、蒸汽殺青（34.6±0.26）mg/g。芒果苷的含量為滾筒殺青（8.67±0.26）mg/g、微波殺青（7.97±0.19）mg/g、蒸汽殺青（8.88±0.24）mg/g。從圖2中可以看出，不同的殺青工藝的對(duì)3種咖啡葉茶中咖啡堿和葫蘆巴堿的含量影響不大，差異不顯著（P＞0.05）；但是對(duì)于兒茶素、綠原酸和芒果苷這幾種多酚類(lèi)的抗氧化物質(zhì)的含量有影響，差異顯著（P＜0.05）；蘆丁含量極少，差異不顯著（P＞0.05）。滾筒殺青制作的咖啡葉茶中綠原酸的含量比起微波殺青和蒸汽殺青來(lái)說(shuō)含量最高，而在蒸汽殺青咖啡葉茶中，蘆丁、兒茶素、綠原酸這幾種活性物質(zhì)的保留量都是低的，說(shuō)明不同殺青工藝對(duì)于咖啡葉茶中刺激性的生物堿成分影響不大，但是對(duì)于多酚類(lèi)抗氧化物質(zhì)成分的含量影響大，滾筒殺青和微波殺青比起蒸汽殺青工藝能夠更好的保留咖啡葉茶中抗氧化成分。

圖1標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromat ogrammap of reference substance

表3 咖啡葉茶六種功能成分含量Table 3 The content of six functional components of coffee leaves tea 單位：mg/g

圖2三種殺青方式咖啡葉的功能成分柱狀圖Fig.2 Histogram of functional components of coffee leaves in three fixation ways

2.3 殺青方式對(duì)咖啡葉茶自由基清除活性影響

對(duì)不同殺青工藝下制成的咖啡葉茶進(jìn)行提取，對(duì)其提取液的DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4，以抗壞血酸為參照，計(jì)算出3種不同殺青方式的咖啡葉茶樣品的DPPH自由基清除能力為滾筒殺青（48.5 mg.Vc/g）＞微波殺青（46.2 mg.Vc/g）＞蒸汽殺青（45.8 mg.Vc/g），ABTS自由基清除能力為滾筒殺青（65.7 mg.Vc/g）＞微波殺青（58.8 mg.Vc/g）＞蒸汽殺青（56.5 mg.Vc/g），可以看出3種咖啡葉茶的水提物均具有良好的抗氧化活性，且對(duì)水溶性ABTS自由基的清除能力明顯高于脂溶性DPPH自由基清除能力。圖3顯示了不同咖啡葉中的6種有效成分含量和自由基清除活性的趨勢(shì)，可以看出多酚類(lèi)的累積量最高（尤其是綠原酸和兒茶素）。在3種不同殺青方式的咖啡葉茶中綠原酸，兒茶素和芒果苷的含量都排在前3位，其次才是生物堿類(lèi)，蘆丁的含量極少。滾筒殺青咖啡茶的綠原酸含量比微波和蒸汽都要高很多，且差異顯著。而蒸汽殺青咖啡茶的綠原酸含量在3種茶中的保留量都最低，這與我們的DPPH和ABTS自由基清除能力的趨勢(shì)有一致性，蒸汽殺青咖啡葉茶的自由基清除能力最低。

表4 3種殺青咖啡葉DPPH和ABTS自由基清除能力Table 4 DPPH and ABTS radical scavenging ability of threefixation in coffee leaves 單位：mg.Vc/g

圖3功能性成分和自由基清除率對(duì)比趨勢(shì)圖Fig.3 Trend chart comparing functional ingredients and radical scavenging rate

3 討論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，滾筒殺青咖啡葉茶除了外形、葉底偶有不均，在湯色、滋味、香氣和內(nèi)含成分各方面都表現(xiàn)優(yōu)越。滾筒殺青金屬導(dǎo)熱，葉溫升溫快，但受熱欠均勻，可能導(dǎo)致少部分焦點(diǎn)糊邊，葉底不均勻[18]。微波殺青咖啡葉茶在外形湯色葉底方面的表現(xiàn)都良好，但是香氣和滋味較淡，多酚類(lèi)物質(zhì)也相對(duì)較高。這在朱德文等[19]綠茶殺青的加工研究中發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，另外在其他材料，如桑葉、藍(lán)莓葉和金花茶等中也觀察到類(lèi)似現(xiàn)象[20-22]。微波殺青受熱均勻，由葉內(nèi)向葉表迅速升溫，葉底勻整嫩綠明亮。蒸汽殺青咖啡葉茶澀味最強(qiáng)，可能是由于蒸汽殺青升溫較慢，殺青時(shí)間較短，酯型兒茶素減少量少，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生氨基酸增加量也少因此口感偏苦澀[23]。且蒸汽殺青揉捻的時(shí)候含水量高，揉捻的時(shí)候會(huì)揉碎部分葉邊，導(dǎo)致葉底不夠均勻。

在測(cè)定的6種品質(zhì)成分中，其中生物堿類(lèi)的物質(zhì)咖啡堿和葫蘆巴堿的含量差異不大，但多酚類(lèi)的兒茶素、綠原酸和芒果苷的含量因殺青工藝的不同，其含量差異顯著，蘆丁含量極少，差異不顯著。研究表明，“殺青”工藝最主要的就是利用高溫“鈍化”酶的活性，在后續(xù)揉捻烘炒過(guò)程中才能保證多酚類(lèi)物質(zhì)不會(huì)被酶促氧化分解[24]。生物堿類(lèi)的物質(zhì)性質(zhì)較穩(wěn)定[25]，在殺青過(guò)程中受酶促作用影響小，因此咖啡堿和葫蘆巴堿成分含量變化不大。殺青的實(shí)質(zhì)就是發(fā)生酶的熱變性，這里的酶主要指的是多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶，不同殺青方法酶熱變性的程度和時(shí)間不同，對(duì)多酚類(lèi)物質(zhì)的酶促氧化作用不同[26]。兒茶素、綠原酸、芒果苷和蘆丁都屬于多酚類(lèi)物質(zhì)，因此不同殺青工藝處理會(huì)對(duì)咖啡葉茶中的兒茶素、綠原酸、芒果苷和蘆丁的含量造成差異?？Х葮?shù)鮮葉在殺青過(guò)程中，處于濕熱有氧條件，兒茶素極不穩(wěn)定，易發(fā)生氧化、熱解、聚合和轉(zhuǎn)化等一系列作用而使其總量降低[27，28]。微波殺青是一種激化茶葉組織內(nèi)部水分子高速運(yùn)動(dòng)而發(fā)熱的殺青技術(shù)[29]，其升溫迅速而均勻，使酶的熱變性快，兒茶素被氧化分解得少，因此保留得蘆丁、兒茶素和綠原酸含量多。滾筒殺青以鐵為介質(zhì)傳熱，金屬導(dǎo)熱性強(qiáng)，而且滾筒殺青時(shí)間較長(zhǎng)，酶促作用完全被抑制，因此保留的綠原酸等物質(zhì)含量高。

3種殺青方式的咖啡葉茶在自由基清除能力上的表現(xiàn)是滾筒和微波殺青咖啡茶無(wú)論是DPPH自由基清除還是ABTS自由基清除能力都比蒸汽殺青咖啡葉茶要更好。清除自由基是表征抗氧化能力的一個(gè)指標(biāo)，抗氧化能力越強(qiáng)的咖啡葉茶中可能存在的抗氧化活性物質(zhì)才會(huì)更多[30]。蒸汽殺青工藝的熱量傳遞以水蒸汽為主，在水升溫形成穿透力強(qiáng)的水蒸氣過(guò)程中，水比熱容大，升溫慢，所需時(shí)間長(zhǎng)[31]。溫度對(duì)酶的催化是兩重性的[32]，在開(kāi)始溫度還沒(méi)達(dá)到使酶變性溫度時(shí)，在這種高濕升溫的條件下，反而酶促作用會(huì)更活躍，咖啡葉中的黃酮類(lèi)、單寧類(lèi)和植酸類(lèi)物質(zhì)的氧化縮合和水解程度會(huì)更高，保留率低[33]，因此反而蒸汽殺青咖啡葉茶的自由基清除能力比滾筒殺青和微波殺青低。

4 結(jié)論

3種不同殺青方式中，咖啡葉茶的咖啡堿和葫蘆巴堿含量差異不大，蘆丁的含量在3種殺青方式中含量都極少。滾筒殺青的咖啡葉茶滋味和香氣好，但外形葉底欠勻整，保留的綠原酸含量最多，芒果苷等物質(zhì)含量也相對(duì)高；微波殺青的咖啡葉茶外形、湯色和葉底各方面都表現(xiàn)出色，而且保留的綠原酸、兒茶素和芒果苷的含量都較高，但滋味和香氣略淡；蒸汽殺青的咖啡葉茶在外形和內(nèi)在品質(zhì)上相對(duì)表現(xiàn)較差，在3者的自由基清除實(shí)驗(yàn)中，蒸汽殺青咖啡葉比起滾筒殺青和微波殺青也是最差的。因此，在咖啡葉茶的加工制作過(guò)程中，滾筒殺青和微波殺青在各方面都優(yōu)于蒸汽殺青，可將這兩種殺青方式根據(jù)不同產(chǎn)品需求引入咖啡葉茶的制作工藝，可以為咖啡葉茶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。