水貂親緣關(guān)系鑒定及繁殖性狀分子標(biāo)記研究進(jìn)展

宋姍姍，宋興超，張如，楊童奧，劉琳玲，叢波，林鵬

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林省特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部特種經(jīng)濟(jì)動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春130112；2.銅仁學(xué)院，貴州銅仁554300；3.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州121013）

分子標(biāo)記以特異性DNA片段的核苷酸變異為基礎(chǔ)，能夠直接反映出DNA水平的遺傳多態(tài)性、生物個體或種群間基因組中差異的一種遺傳標(biāo)記技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)為范圍廣、遺傳穩(wěn)定和直觀準(zhǔn)確，是動物領(lǐng)域遺傳育種方向的一項(xiàng)新興應(yīng)用技術(shù)。分子標(biāo)記在多個領(lǐng)域中都有應(yīng)用，其中在標(biāo)記輔助選擇（Marker assisted selection，MAS）上的應(yīng)用推動了育種工作的發(fā)展[1]。早期水貂的品種鑒定方法是通過水貂的品種形態(tài)學(xué)標(biāo)記和生產(chǎn)性能測定，現(xiàn)今已發(fā)展到在分子水平上對水貂進(jìn)行品種資源的多樣性分析和相關(guān)重要經(jīng)濟(jì)性狀的測定。分子標(biāo)記在水貂品種育種方面和遺傳評價的廣泛應(yīng)用，對我國水貂種貂繁殖、良種化及核心群體的建立具有十分重要的意義[2]。

2007年首次構(gòu)建水貂簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR）遺傳圖譜，該圖譜的建立推動水貂的分子遺傳標(biāo)記的發(fā)展，SSR分子標(biāo)記因其多態(tài)性高、信息量大、PCR檢測方便及分布在全基因組中而被廣泛應(yīng)用于許多遺傳研究中，成為最受歡迎的分子標(biāo)記之一，然而，由于缺乏有關(guān)參考基因組側(cè)翼標(biāo)記序列的信息，這些標(biāo)記的可用性受到阻礙[3]。Cai Z等[4]首次公布了水貂全基因組信息，這使得應(yīng)用序列基因分型（Genotyping-by-Sequencing，GBS）鑒定整個水貂基因組中的SNP成為可能。下一代測序（Next-generation sequencing，NGS）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其優(yōu)點(diǎn)是能降低成本并且能高通量的進(jìn)行基因分型。限制性核酸內(nèi)切酶（Restriction endonuclease，RE）可以降低基因組的復(fù)雜性，通過使用NGS生成序列標(biāo)簽，我們選擇對甲基化敏感的RE可以避免基因組的重復(fù)區(qū)域，從而降低基因組的復(fù)雜性。GBS獲得全基因組遺傳標(biāo)記已成為動物的遺傳學(xué)研究和育種的熱點(diǎn)[5，6]?？茖W(xué)家們在許多非模式動物中采用了相同的策略發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記來進(jìn)行種群、遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究。

1 分子標(biāo)記在水貂品種親緣關(guān)系中的研究進(jìn)展

DNA序列的差異可以判斷物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近程度，即DNA序列的相似度越高，其親緣關(guān)系越近。研究發(fā)現(xiàn)在基因水平上的第一代個體具有特別微小的差異，在分化的過程中，其變異數(shù)量越來越多。由此研究人員可應(yīng)用DNA標(biāo)記分析和檢測動物品系間親緣關(guān)系和遺傳多樣性[7]。

微衛(wèi)星，簡單序列重復(fù)（SSRs）或短串聯(lián)重復(fù)（Short tandem repeats，STRs）序列，是基因組中由短DNA基因序列（通常2～6個核苷酸長）連續(xù)重復(fù)多次（如GTGTGTGTGT）組成的區(qū)域[8]。在真核生物基因組中，均勻分布大量簡單重復(fù)序列，每個重復(fù)片段僅有各2～6個核心堿基組成，這些串聯(lián)或簡單重復(fù)序列被稱為微衛(wèi)星，通過計(jì)算微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)在群體中的等位基因頻率，進(jìn)行親緣關(guān)系的確定[9]。王雷等[10]利用微衛(wèi)星標(biāo)記對單個水貂群體進(jìn)行多態(tài)性測定和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，研究發(fā)現(xiàn)銀藍(lán)水貂和珍珠水貂聚為一類，丹麥紅眼白水貂和丹麥標(biāo)準(zhǔn)水貂聚為一類，該結(jié)果符合實(shí)際，說明利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)可識別和研究水貂品種、類群間的親緣關(guān)系。

1994年簡單序列重復(fù)區(qū)間（Inter-simple sequence repeat，ISSR）標(biāo)記首次被提出，是一種新型的簡單重復(fù)序列DNA擴(kuò)增多態(tài)性檢測技術(shù)[11]。ISSR是一個利用真核生物中豐富的SSR基序的多位點(diǎn)顯性標(biāo)記[12]。ISSR使用與SSR序列互補(bǔ)的引物（14～17個）堿基對（bp）[8]，這些引物在3′或5′末端有或沒有短的（1～3 bp）寡核苷酸錨點(diǎn)，從而中斷重復(fù)序列，如（CACACACACAGT）。錨點(diǎn)可以確保引物靶向SSR的任何一個末端。5'錨定引物擴(kuò)增的產(chǎn)物包括目標(biāo)SSR序列本身及其之間的DNA區(qū)域，而3'錨定引物擴(kuò)增的產(chǎn)物主要包括目標(biāo)SSR之間的區(qū)域。PCR在一個反應(yīng)中產(chǎn)生多個長度可變的DNA片段（每個片段被認(rèn)為是一個位點(diǎn)），進(jìn)行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分型。這些片段的數(shù)量和大小可作為遺傳變異研究的基礎(chǔ)[13]。2010年，楊洪雁等[14]采用ISSR標(biāo)記技術(shù)分析水貂遺傳多樣性，進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)5個水貂群體被分為兩類：短毛黑、咖啡、藍(lán)寶石和紅眼白水貂聚到一類，而僅有金州黑貂聚為一類，表明金州黑貂和其他4種貂的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其中咖啡色貂和藍(lán)寶石貂是首先聚在一起的兩種品種，表明它們親緣關(guān)系很近。因此，我們可利用分子育種技術(shù)研究水貂種群的親緣關(guān)系。

隨機(jī)擴(kuò)增微衛(wèi)星多態(tài)性（Random amplified microsatellite polymorphism，RAMP）是利用隨機(jī)引物和微衛(wèi)星的上游或下游引物一起作為該擴(kuò)增的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該方法更適合于研究遺傳背景尚不太清晰的物種遺傳多樣性[15]。PCR分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于動物品種鑒定，系統(tǒng)發(fā)育分析和種群研究。王紅梅等[16]通過分析遺傳距離和基因分化系數(shù)發(fā)現(xiàn)，水貂與彩貂的品種間遺傳分化程度較低，因此該遺傳變異是群內(nèi)變異。

2 分子標(biāo)記在水貂繁殖相關(guān)性狀基因中的研究進(jìn)展

產(chǎn)仔數(shù)、成活率和初生窩重等是衡量水貂繁殖性狀的指標(biāo)。水貂通常在溫、濕度和食物等較適宜的季節(jié)出生，通過延遲胚胎著床，使幼仔的初生時間延后，從而保證存活率[17-22]。曹新燕等[23]發(fā)現(xiàn)由于水貂繁殖性狀的變異系數(shù)較大，即遺傳選擇力較大，可以通過選育來提高水貂的繁殖性能。研究表明水貂存在專性滯育現(xiàn)象，導(dǎo)致水貂妊娠期變異系數(shù)較大。

NCOA1是配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一[24]，與DNA上的核受體結(jié)合增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)控動物的生長發(fā)育、繁殖等一系列生理過程[25]。NCOA1是生殖激素的“開關(guān)”，影響胎盤的形態(tài)和胚胎的存活率[26]。霍自雙等[27]采用RFLP-SSCP技術(shù)研究水貂NCOA1基因，篩查SNPs并分析其與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)g.151536T＞C位點(diǎn)與水貂的產(chǎn)仔數(shù)和活仔數(shù)性狀具有極顯著差異（P＜0.01)，其中AB型個體的產(chǎn)仔數(shù)和活仔數(shù)高于AA型個體。g.185142C＞A位點(diǎn)對繁殖性狀無影響（P＞0.05)。我們推斷，NCOA1基因可作為水貂繁殖性狀的候選基因，從而為水貂育種提供理論依據(jù)。

FSH是一種糖蛋白激素，在下丘腦-垂體-卵巢軸上，它通過血液循環(huán)系統(tǒng)，使下丘腦分泌抑制因子作用于腦垂體，最后運(yùn)輸?shù)铰殉?，與相應(yīng)的特異性受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用[28，29]。研究表明，F(xiàn)SH基因可以調(diào)控性腺功能和卵巢發(fā)育[30]，還可以通過刺激動物卵泡的生長來促進(jìn)動物的性成熟[31]。Van等應(yīng)用FSH刺激休情期母貂后，可加快卵泡的生長速度，使停滯生長的卵泡進(jìn)入減數(shù)分裂階段[32]。王紅梅等[33]在外顯子3處發(fā)現(xiàn)了一個SNPs，該突變位點(diǎn)與產(chǎn)仔性狀無顯著差異?；糇噪p等[27]采用PCR-SSCP技術(shù)檢測了紅眼白水貂FSH基因與繁殖性能的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)FSH基因的g.1228G＞A位點(diǎn)對紅眼白水貂的產(chǎn)仔數(shù)有顯著影響（P＜0.01），分析該位點(diǎn)3個基因型發(fā)現(xiàn)AA和AB型個體活仔數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)明顯高于BB型個體，并且在繁殖性能上呈現(xiàn)BB＜AB＜AA的遞增趨勢。g.1866T＞C位點(diǎn)對產(chǎn)仔數(shù)有顯著影響（P＜0.05）。DD型個體產(chǎn)仔數(shù)高于CD型個體。我們可以推斷，F(xiàn)SH可以刺激水貂的發(fā)情和加快卵泡的生長，從而調(diào)控動物的繁殖性能。分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在水貂繁殖性狀相關(guān)的兩個基因上的應(yīng)用，篩查到的突變位點(diǎn)可作為水貂繁殖性狀的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，為水貂的遺傳育種奠定理論基礎(chǔ)。

3 展望

常規(guī)育種方法存在不足，如需要長期進(jìn)行品種登記和種公貂利用年限短且還沒達(dá)到生產(chǎn)年限就會被淘汰。然而分子育種具有明顯的優(yōu)越性，能有效提高研究目的性和研究效率。分子育種的優(yōu)越性是在DNA水平上，可達(dá)到早期選種和選育的目的，可準(zhǔn)確地選育低遺傳力性狀、限性性狀和難以測量的性狀的品種。

分子遺傳標(biāo)記技術(shù)是動物品種或基因型鑒定一種新的有力工具。一個物種的標(biāo)記系統(tǒng)并不一定說明它對另一個物種的適用性，標(biāo)記的選擇通常取決于標(biāo)記系統(tǒng)使用的目的。分子遺傳標(biāo)記技術(shù)是一種簡單、經(jīng)濟(jì)、快速、廉價和有效的研究動物遺傳多樣性的系統(tǒng)。通過分子遺傳標(biāo)記來鑒定親緣關(guān)系，為品種鑒定提供了一種可靠的方法，有助于育種者尋找新的變異來源和探索控制遺傳數(shù)量性狀的遺傳因素。

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