兩種不同品種人參HPLC指紋圖譜研究

侯淑麗，張晶晶，張寧，曲正義，李亞麗，侯微，鄭培和※

（1.吉林省醫(yī)藥中等職業(yè)學(xué)校，吉林吉林130031；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春130112）

人參（Panax ginseng C.A.Mey.）為五加科人參屬多年生草本植物，別名人銜、土精、地精和棒槌等，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，主要分布于我國東北、朝鮮、韓國、日本及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)[1]。人參是百草之王，地下根及根莖入藥。人參具有大補元氣、復(fù)脈固脫、補脾益肺、生津養(yǎng)血和安神益智等功效[2]。由于人參具有重要的藥用價值，所以其需求量巨大。人參資源在濫采亂挖之下遭到嚴(yán)重破壞，1992年，人參被列為國家珍稀瀕危植物，現(xiàn)在市場上銷售的人參幾乎都是人工種植品[3-4]。為了保證人參性狀單一，質(zhì)量穩(wěn)定，科研人員開始進(jìn)行人參品種選育工作，至今我國已選育十多個人參品種。這些人參品種在農(nóng)藝性狀、抗病性及產(chǎn)量等方面都有較大差別，它們在藥材品質(zhì)上是否有區(qū)別，需要深入研究。指紋圖譜在中藥質(zhì)量控制檢驗中具有模糊性和整體性雙重特點，能夠在每個峰尚不明確情況下系統(tǒng)、整體、專屬地表征中藥所共有的內(nèi)在特征，能夠全面、有效地評價中藥的內(nèi)在質(zhì)量[5-12]。因此，本實驗利用中藥色譜指紋圖譜技術(shù)對其中兩個主推品種進(jìn)行分析，以期為人參品種鑒別和質(zhì)量評價提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

安捷倫1200-6310高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括脫氣機、四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器和離子阱質(zhì)量分析器（美國安捷倫公司）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HC-2514高速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；CP64電子天平（常州奧豪斯儀器有限公司）。

1.2 試劑與材料

乙腈、甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；乙酸銨、氨水（色譜純，Sigma公司）；其它試劑為分析純；實驗用娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈有限公司）。實驗材料采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所左家北方藥用植物資源圃，5年生，采集時間2018年9月，每個品種隨機取10株。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent TC-C18（2）（250 mm 4.6 mm，5m）；流動相A為5 mM醋酸銨、1 mM氨水溶液，B為5 mM醋酸銨、1 mM氨水溶液-乙腈（1∶9），梯度洗脫：0～4 min，20%B；4～7 min，20%B-29%B；7～10 min，29% B-35% B；10～12 min，35% B；12～17 min，35%B-53.3%B；17～22 min，53.3%B-56.6%B；22～23 min，56.6%B-95%B；23～28 min，95%B；29～30 min，95%B-20%B；30～35 min，20%B。檢測波長203 nm。體積流量1.0 mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣量20L；記錄35 min內(nèi)的色譜圖。

2.2 供試品溶液的制備

分別取康美1號、福星1號兩種不同人參品種各10株，洗凈，45℃干燥，粉碎，過60目篩。精密稱取人參粉末0.2 g，加入1 mL75%乙醇，混勻，放置過夜，超聲提取30 min，12 000 rpm離心5 min，取上清液過0.22m有機濾膜，即得供試液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗取康美1號第2株供試液，按照“2.1”色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。

2.3.2 重現(xiàn)性試驗取康美1號第2株樣品粉末6份，分別按“2.2”項下方法制備供試液，各取20L進(jìn)樣，記錄色譜圖。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗取康美1號第2株樣品溶液，于制樣后0、4、8、12、24、48 h按照“2.1”色譜條件，吸取20L進(jìn)樣，記錄色譜圖。

2.4 共有峰的選擇

在相同的色譜條件下，不同批次的人參色譜圖所共同具有的色譜峰即為共有峰。根據(jù)色譜數(shù)據(jù)計算指紋圖譜中的共有峰。

2.5 指紋圖譜的相似度

指紋圖譜的相似度代表指紋圖譜的整體相關(guān)性，包括色譜指紋圖譜的重疊率和共有峰強度信息。本實驗采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（V2.0）。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察結(jié)果

經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)分析，精密度試驗結(jié)果相似度≥0.976，RSD小于3%，表明儀器精密度良好。重現(xiàn)性試驗結(jié)果相似度≥0.969，RSD小于3%，表明該樣品方法重現(xiàn)性良好。穩(wěn)定性試驗結(jié)果相似度≥0.966，RSD小于3%，表明樣品溶液48 h內(nèi)有良好穩(wěn)定性。

3.2 共有峰的標(biāo)定

將不同品種人參樣品的HPLC色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，進(jìn)行色譜峰匹配，選擇平均數(shù)法及時間窗寬度為0.10 s生成對照圖譜，采用多點校正法建立人參指紋圖譜，選擇人參中的主要成分且分離較好的色譜峰作為共有峰，通過質(zhì)譜共標(biāo)定7個共有峰，見圖1。

3.3 康美1號指紋圖譜

在203 nm波長下，共檢測到色譜峰83個，其中共有峰52個，共有率62.7%，整個色譜圖基線較平整，平均相似度≥0.916，得到康美1號的指紋圖譜，見圖2。

3.4 福星1號指紋圖譜

在203 nm波長下，共檢測到色譜峰63個，其中共有峰38個，共有率60.3%，整個色譜圖基線較平整，平均相似度≥0.938，得到福星1號的指紋圖譜，見圖3。

圖1人參對照圖譜（標(biāo)定共有峰分別是人參皂苷Re、Rg1、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rd）Fig.1 Reference fingerprint of ginseng(The common peaks are ginsenoside Re，Rg1，Ro，Rb1，Rc，Rb2，Rd)

圖2 10批次康美1號人參HPLC色譜圖Fig.2 HPLC fingerprint of 10 batches of Kangmei No.1

圖3 10批次福星1號人參HPLC色譜圖Fig.3 HPLC fingerprint of 10 batches of Fuxing No.1

3.6 不同品種人參HPLC色譜分析

我們比較了康美1號、福星1號兩個不同人參品種HPLC對照譜圖，見圖4，發(fā)現(xiàn)兩個品種譜圖總體相近，但也有些差別，這種差異主要體現(xiàn)在檢出色譜峰和共有峰數(shù)量上的不同；康美1號與福星1號品種間相似度是0.875。結(jié)果表明不同品種人參在化學(xué)組成上有所不同，可為不同品種人參的質(zhì)量評價和利用提供依據(jù)。

圖4兩品種人參HPLC對照譜圖（S1為康美1號，S2為福星1號）Fig.4 Reference fingerprints of two varieties of ginseng(S1 is Kangmei No.1，S2 is Fuxing No.1)

4 結(jié)論

本研究利用中藥色譜指紋圖譜技術(shù)建立了兩種不同人參品種的化學(xué)指紋圖譜。利用高效液相色譜技術(shù)對兩種人參各10批次進(jìn)行了化學(xué)成分分析，建立了不同品種人參化學(xué)指紋圖譜，各共有峰特征性明顯。實驗結(jié)果顯示兩品種化學(xué)組成相近，品種內(nèi)植株間平均相似度在0.916以上；兩個品種譜圖總體類似，但也有些差別，這種差異主要體現(xiàn)在檢出色譜峰和共有峰數(shù)量上的不同。康美1號與福星1號品種間相似度是0.875。實驗表明中藥色譜指紋圖譜能夠提供人參化學(xué)成分信息，為人參的品種分類鑒別和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。