傷濕祛痛膏的UPLC-Orbitrap-MSn成分分析及其抗氧化、抗炎作用研究

陳揚(yáng)，李朝峰，張雪，趙苑伶，劉妍，劉靜，趙崇軍，林瑞超，馬志強(qiáng)*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病，多見(jiàn)四肢關(guān)節(jié)滑膜炎，與T 淋巴細(xì)胞、Th1 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)功能紊亂密切相關(guān)，致殘率較高，急需強(qiáng)效的治療策略［1-3］。傷濕祛痛膏記載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（中藥成方制劑第8冊(cè)）》［4］，由生川烏、生草烏、麻黃、蒼術(shù)、當(dāng)歸、白芷、干姜、山柰、八角茴香、薄荷腦、冰片、樟腦和水楊酸甲酯等制得，主治風(fēng)寒濕凝滯筋骨證，常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［5］，但其成分及作用機(jī)制尚不明確。

機(jī)體內(nèi)存在自由基的產(chǎn)生與清除，正常情況下處于動(dòng)態(tài)平衡中。當(dāng)體內(nèi)自由基過(guò)多時(shí)，會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，因此自由基清除能力是抗炎活性的表征之一［6］。DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）常被用作自由基清除能力評(píng)價(jià)，其原理是DPPH 從抗氧化劑中吸收一個(gè)氫原子，使得其溶液顏色由紫色變?yōu)辄S色，吸光度降低［7］。

白細(xì)胞介素-17（IL-17）家族是由IL-17 A～F組成的細(xì)胞因子亞群，在急性和慢性炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。IL-17 家族通過(guò)其相應(yīng)的受體發(fā)出信號(hào)，激活包括NF-κB、MAPKs和C/EBPs在內(nèi)的下游通路，誘導(dǎo)抗菌肽、細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，共同參與機(jī)體炎癥及免疫反應(yīng)進(jìn)程［8］。

本研究通過(guò)超高效液相-線性軌道離子阱-高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)傷濕祛痛膏成分進(jìn)行了解析，并測(cè)定了其氧化自由基清除率來(lái)表征其抗炎能力，通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)［9］探究傷濕祛痛膏對(duì)經(jīng)典炎癥信號(hào)通路IL-17 家族通路靶點(diǎn)的作用效果，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Thermo-LTQ-Orbitrap-XL-HRMSn線性離子阱-串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，配有：熱噴霧離子源（HESI）、Xcalibur 2.1 化學(xué)工作站（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；Utimate 3000 UHPLC 超高液相色譜系統(tǒng)，含二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD 檢測(cè)器（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；UH5300 型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本株式會(huì)社日立制作所）；MS105DU 型萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料及試劑

傷濕祛痛膏浸膏（哈爾濱力強(qiáng)藥業(yè)有限公司）；乙酸（質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)Thermo Scientific 公司）；甲醇（質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)Thermo Scientific 公司）；甲醇（分析純，北京化工廠）；無(wú)水乙醇（分析純，北京化工廠）；雙蒸水（香港屈臣氏集團(tuán)）；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH，成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)：PS201012-09）。

1.3 超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：AQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.3%乙酸水溶液（A），甲醇溶液（B）；梯度洗脫條件：0～5 min（10%～40%B），5～18 min（40%～60%B），18～30 min（60%～80%B），30～40 min（80%～100%B），40～45 min（100%～100%B）；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件

HESI 電噴霧離子源，正負(fù)離子檢出模式，電離源電壓4 KV，離子源溫度350 ℃，氣化室溫度300 ℃，毛細(xì)管電壓25 V，鏡筒透鏡補(bǔ)償電壓110 V，鞘氣和輔助氣為高純氮?dú)猓兌龋?9.99%），鞘氣流速40 arb，輔助氣流速20 arb；激活能量單位0.25 q；激活時(shí)間30 ms；歸一化碰撞能量35%；傅里葉高分辨掃描范圍m/z 50～1 300 Da，傅里葉變換全掃分辨率為30 000，二級(jí)和三級(jí)質(zhì)譜選取上一級(jí)豐度最高的3 個(gè)峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離碎片掃描。

1.3.3 樣品制備

取一定量的傷濕祛痛膏浸膏用甲醇配制成1 g/mL的母液，超聲30 min，用甲醇稀釋至6.25 mg/mL，12 000 rpm 4 ℃離心15 min，取上清液。

1.4 UV-Vis檢測(cè)DPPH自由基清除

1.4.1 DPPH溶液的制備

精密稱取一定量的DPPH，加入一定量的無(wú)水乙醇，配制成0.2 mmol/L DPPH母液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4.2 供試品溶液的制備

取一定量的傷濕祛痛膏浸膏用90%甲醇水溶液配制成1 g/mL 的母液，超聲30 min，過(guò)濾，用90%甲醇水溶液配制成一定濃度的傷濕祛痛膏溶液，取3 mL 傷濕祛痛膏溶液加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液，避光反應(yīng)30 min，待測(cè)。

1.4.3 空白組溶液的制備

取3 mL 90%甲醇水溶液加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，避光反應(yīng)30 min，待測(cè)。

1.4.4 對(duì)照組溶液的制備

取3 mL 傷濕祛痛膏溶液加入2 mL 90%甲醇水溶液，避光反應(yīng)30 min，待測(cè)。

1.4.5 反應(yīng)及測(cè)定

將避光反應(yīng)30 min后的供試品、空白組、對(duì)照組溶液移取到1 cm 比色皿中，于517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定，測(cè)定3次取平均值。

1.4.6 專屬性考察

取空白組溶液和對(duì)照組溶液，在200～900 nm 之間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，觀察對(duì)照組溶液在DPPH 的最大吸收波長(zhǎng)處是否有吸收。

1.4.7 線性關(guān)系考察

精密移取不同體積的傷濕祛痛膏母液，分別置于25 mL 容量瓶中，加入90%甲醇水溶液至刻度線，定容，配制成不同濃度的傷濕祛痛膏溶液。分別取3 mL不同濃度的傷濕祛痛膏溶液，向內(nèi)加入2 mL 2 mmol/L的DPPH 溶液，避光反應(yīng)30 min，在517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度均值，計(jì)算自由基清除率，線性擬合。

1.5 分子對(duì)接

1.5.1 對(duì)接分子的準(zhǔn)備

使用Chemdraw19 軟件繪制傷濕祛痛膏質(zhì)譜解析成分，能量最小化處理保存成mol2 格式文件，利用SYBYL X2.1.1 軟件進(jìn)行加氫和加電荷處理，保存成pdb格式。

1.5.2 對(duì)接受體的準(zhǔn)備

通過(guò)KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢IL-17 家族通路靶點(diǎn)，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)［10］獲得靶點(diǎn)三維結(jié)構(gòu)，利用SYBYL X2.1.1軟件去除水分子及原有配體，加氫、加電荷處理，保存成pdb格式。

1.5.3 柔性分子對(duì)接

通過(guò)SYBYL X2.1.1 軟件，采用Surflex-Dock 柔性對(duì)接算法，選擇“automatic”自動(dòng)對(duì)接方式，每次對(duì)接保留Total-score得分前二十的構(gòu)象。

2 結(jié)果

2.1 傷濕祛痛膏的化學(xué)成分鑒定

采用正負(fù)離子模式分別進(jìn)行掃描，通過(guò)和已有文獻(xiàn)報(bào)道比對(duì)，鑒定出蒼術(shù)（CZ）27 種成分、烏頭（WT）25 種成分、干姜（GJ）20 種成分、白芷（BZ）4 種成分、當(dāng)歸（DG）4 種成分、八角茴香（BJ）2 種成分、麻黃（MH）2 種成分、山柰（SN）1 種成分，其中多種成分在多味藥中均含有，合計(jì)鑒別出85 種成分，主要為生物堿、黃酮、香豆素、二苯基庚烷類化合物，結(jié)果見(jiàn)圖1、表1及表2。

圖1 傷濕祛痛膏總離子流圖

表1 傷濕祛痛膏正離子模式成分定性分析

續(xù)表1

表2 傷濕祛痛膏負(fù)離子模式成分定性分析

2.2 UV-Vis檢測(cè)DPPH自由基清除

專屬性考察結(jié)果可以看出，傷濕祛痛膏溶液在DPPH 的最大吸收波長(zhǎng)處沒(méi)有吸收，對(duì)測(cè)定沒(méi)有影響，見(jiàn)圖2。因此，選擇文獻(xiàn)報(bào)道［32］的517 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，將待測(cè)液與DPPH 溶液避光反應(yīng)30 min 后測(cè)定。以DPPH 自由基清除率Y 為縱坐標(biāo)，傷濕祛痛膏溶液的濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性考察結(jié)果見(jiàn)表3。傷濕祛痛膏溶液在0.1～0.7 mg/mL 濃度范圍內(nèi)與DPPH 自由基清除率呈良好的線性關(guān)系，計(jì)算得出DPPH 自由基清除率的半數(shù)抑制濃度IC50值為0.345 7 mg/mL，說(shuō)明傷濕祛痛膏具有體外清除DPPH自由基的能力，具有一定抗炎活性。

圖2 專屬性考察結(jié)果

表3 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3 分子對(duì)接

將質(zhì)譜鑒定出的結(jié)構(gòu)明確的62 個(gè)成分與IL-17家族通路的55 個(gè)靶點(diǎn)，通過(guò)SYBYL X 2.1.1 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，每次對(duì)接顯示得分前二十的對(duì)接構(gòu)象，3 410 次對(duì)接共產(chǎn)生68 200 個(gè)對(duì)接構(gòu)象。根據(jù)給出對(duì)接打分值Total-score，＞5 分為對(duì)接成分與靶點(diǎn)間具有活性，＞7 分為具有很強(qiáng)的活性。使用Origin Lab 將對(duì)接結(jié)果繪制成熱圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，55 個(gè)靶點(diǎn)全部有得分≥5 分的相應(yīng)對(duì)接成分，即傷濕祛痛膏成分對(duì)IL-17 家族全部靶點(diǎn)具有對(duì)接活性。52 個(gè)靶點(diǎn)具有打分值≥7 分的對(duì)接成分，占比為94.55%，大部分成分與靶點(diǎn)的對(duì)接得分都在7 分以上，并且干姜中的二苯基庚烷類化合物表現(xiàn)出極好的對(duì)接活性，與大多數(shù)靶點(diǎn)的得分都在10 分以上。說(shuō)明傷濕祛痛膏對(duì)IL-17 家族炎癥通路的靶點(diǎn)具有良好的對(duì)接活性。將對(duì)接打分值前十的對(duì)接構(gòu)象使用Discovery Studio 2020可視化，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 對(duì)接結(jié)果Total-score熱圖

圖4 最佳對(duì)接構(gòu)象結(jié)果圖

3 討論

DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考察了DPPH 的濃度及反應(yīng)體積，傷濕祛痛膏的濃度、體積及二者的反應(yīng)時(shí)間后，參考文獻(xiàn)確定DPPH 的濃度為2 mmol/mL，反應(yīng)時(shí)間為30 min。

LC-MS 實(shí)驗(yàn)考察了柱溫、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%乙酸水、甲醇-0.3%乙酸水體系，考慮到峰型和分離度，最終選定了30 ℃柱溫、甲醇-0.3%乙酸水為流動(dòng)相。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎終生患病率高達(dá)1%，是最常見(jiàn)的全身性炎癥關(guān)節(jié)炎。目前臨床用藥多是甲氨蝶呤聯(lián)合糖皮質(zhì)激素，或者與TNF、B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、白細(xì)胞介素的單克隆抗體抑制劑等價(jià)格較高的生物制品聯(lián)用［33-35］。傷濕祛痛膏作為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥的常用藥，具有良好的應(yīng)用前景。本文通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用、自由基清除實(shí)驗(yàn)及分子對(duì)接方法，闡明了傷濕祛痛膏抗氧化、抗炎作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)室前期的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，傷濕祛痛膏的組成藥味很多，涉及的靶點(diǎn)、通路也較多。本文將關(guān)注點(diǎn)放在傷濕祛痛膏成分與經(jīng)典炎癥通路IL-17通路靶點(diǎn)的相互作用。結(jié)果顯示，傷濕祛痛膏的質(zhì)譜鑒定成分對(duì)此通路涉及的靶點(diǎn)具有很強(qiáng)的活性。本研究采用的Surflex-Dock 算法是柔性對(duì)接方式，研究表明此算法在幾種算法中正確率最高［36-37］。分子對(duì)接結(jié)果表明，傷濕祛痛膏可以多靶點(diǎn)起到抗炎作用，且具有良好活性，一定程度上解釋了傷濕祛痛膏治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥的科學(xué)內(nèi)涵，為傷濕祛痛膏的后續(xù)研究提供一定的參考。