DNA條形碼基因ITS和LSU在紅曲菌分類鑒定中的比較分析

李志強，林 風(fēng)，吳麗云*

（福建省微生物研究所 福建省紅曲微生物技術(shù)開發(fā)應(yīng)用工程研究中心 福建省新藥（微生物）篩選重點實驗室，福建 福州 350007）

紅曲菌（Monascus）為一類小型、腐生的絲狀真菌，雖然該屬于1884年才建立[1]，但紅曲菌的應(yīng)用已有上千年的歷史。我國紅曲（紅曲菌發(fā)酵米飯制成的紫紅色曲米）制作的歷史最悠久，其可信記錄最早可追溯至公元740年[2]。用紅曲菌制作的最有名的產(chǎn)品當(dāng)為紅曲，在東亞和東南亞國家被廣泛用作食品著色劑、魚肉防腐劑、醋、酒發(fā)酵劑以及心血管病治療藥，因此，紅曲菌具有重要的經(jīng)濟價值[3-5]?，F(xiàn)代研究表明，紅曲菌可產(chǎn)生多種具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，如莫納可林類、γ-氨基丁酸、麥角甾醇、黃酮類及食用色素等[5-6]，具有降血脂、降血壓、降血糖、抑菌、抗氧化和提高免疫力等多種功效[5-8]。我國工業(yè)化生產(chǎn)的紅曲產(chǎn)品主要有3類，即釀造用紅曲、色曲和功能性紅曲。

進行準(zhǔn)確的物種鑒定和分類在紅曲菌的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中均具有重要意義，是開展其他相關(guān)生物學(xué)科學(xué)研究的基礎(chǔ)條件?，F(xiàn)階段紅曲菌的鑒定和分類主要依靠形態(tài)特征[1]。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定是開展物種鑒定和系統(tǒng)分類工作的重要手段，但需要較高的專業(yè)技術(shù)知識和豐富的經(jīng)驗，程序繁瑣、周期長、標(biāo)準(zhǔn)化程度低、受環(huán)境因素影響大，存在主觀性強、穩(wěn)定性和重復(fù)性差等方面的局限。脫氧核糖核酸條形碼技術(shù)（deoxyribonucleic acid（DNA）barcoding）作為一種新興的物種鑒定方法，以其簡便、準(zhǔn)確、高效、客觀和標(biāo)準(zhǔn)化程度高的優(yōu)勢，一經(jīng)提出就在動物、植物和真菌中得到了廣泛應(yīng)用[9-10]。生物條形碼協(xié)會將其定義為：通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增和測序來獲得一段標(biāo)準(zhǔn)同源序列（500～800堿基對（base pairs，bp）），再將序列進行多重序列比對和聚類分析，從而實現(xiàn)對物種的快速、準(zhǔn)確和自動鑒定[9]。該技術(shù)近年來發(fā)展迅速并形成了標(biāo)準(zhǔn)化，《中國藥典》2015年版已收錄“中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則”作為中藥材質(zhì)量控制的新方法[11]，提出需確定不同物種、不同條形碼序列的種內(nèi)變異閾值。紅曲為藥食兩用的傳統(tǒng)中藥材，但紅曲菌的不同條形碼序列的種內(nèi)及種間變異閾值鮮有報道。核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）和核糖體大亞基（ribosomal large subunit，LSU）被廣泛用于紅曲菌屬的系統(tǒng)發(fā)育分析[12-15]。

本研究從美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中下載不同紅曲菌的ITS和LSU基因序列，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育和遺傳距離的分析方法，比較這兩個基因的鑒定和聚類效果，確定不同紅曲菌的ITS和LSU基因的種間變異閾值及部分紅曲菌的種內(nèi)變異閾值，并用本研究所保存的部分紅曲菌株的基因序列進行驗證，以期為在生產(chǎn)實踐中選擇紅曲菌的條形碼基因提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 序列及菌株來源

通過查閱文獻(xiàn)及在NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫中以“Monascus&28S ribosomal RNA gene”、“Monascus&large subunit ribosomal RNA gene”或“Monascus &internal transcribed spacer”為關(guān)鍵字進行檢索，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載各種紅曲菌不同菌株（具有不同的菌株編號）的ITS和LSU序列。理論上每株紅曲菌的相同基因片段應(yīng)該只有一個GenBank序列號，由于不同的研究者可能對同一株紅曲菌（特別是模式菌株）的同一基因片段進行了測序，因此同一個菌株的相同基因片段可能有多個GenBank序列號，在這種情況下選擇質(zhì)量高、序列長的一條序列作為該菌株的代表序列。

曾描述記載的Monascus種名有30多個[1，14，16-17]，但許多種類被視為同種異名[12-14，16]。結(jié)合形態(tài)特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，現(xiàn)階段紅曲菌屬共包括10種紅曲菌[14-15]，因此在本研究中主要參考BARBOSA R N等[14]的分類系統(tǒng)。

用于驗證的紅曲菌株從本研究所的紅曲菌種資源庫中選取。利用NCBI中基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）對這些菌株的ITS和LSU序列與GenBank數(shù)據(jù)庫已收錄的紅曲菌屬同一基因序列進行比較，若有差異，則提交至GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)C、瓊脂糖和Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-6C穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀：北京六一儀器廠；UVI Fire Reader凝膠成像系統(tǒng)：英國UVItec公司；S1000 PCR儀：美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)

菌株的液體培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[18]。

1.3.2 DNA的提取

菌株培養(yǎng)完成后收集菌絲體，加入液氮研磨成粉末，然后用Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.3.3 PCR擴增和測序

PCR擴增ITS基因采用引物ITS5（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS4（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'），PCR擴增LSU基因采用引物L(fēng)R0R（5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3'）和LR5（5'-TCCTGAGGGAAACTTCG-3'）[19]。PCR擴增體系（50 μL）：10×PCR反應(yīng)緩沖液5 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates，dNTPs）（10 mmol/L）0.75 μL，10 μmol/L的正向引物和反向引物各1 μL，TaqDNA聚合酶（2 U/μL）0.5 μL，DNA模板2 μL，加無菌蒸餾水至50 μL。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃（LSU退火溫度為48 ℃）退火30 s，72 ℃延伸90 s，共34個循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。每次反應(yīng)均設(shè)立不含DNA模板的空白對照組。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，擴增陽性樣本送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進行雙向測序。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

拼接本研究中獲得的序列，并根據(jù)測序圖譜人工校正堿基。采用Clustal X軟件對下載的序列進行排序，去除5'和3'端非對位排列區(qū)。利用MEGA 6.0[20]軟件基于木村雙參數(shù)（Kimura 2-parameter，K2P）模型計算下載的各種紅曲菌的ITS和LSU基因序列的種內(nèi)和種間遺傳距離；并用MEGA 6.0軟件基于K2P模型的鄰接（neighbour-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展1 000次計算各分支的支持率。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用的外類群為黃曲霉（Aspergillusflavus，ITS：DQ683124，LSU：HQ395773）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus，ITS：EF661568，LSU：JN938934）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus，ITS：HQ026746，LSU：FM179606）。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果

下載的各種紅曲菌的ITS和LSU基因序列的信息見表1，共包括了10種紅曲菌的60條ITS基因序列和96條LSU基因序列，且均包含了10種紅曲菌的模式菌株（見圖1）。每種紅曲菌下載的序列數(shù)目在1～36之間。下載的紅曲菌ITS和LSU基因序列經(jīng)排序和編輯后的長度（包括插入和缺失）分別為677 bp和567 bp，可變位點分別為164 bp（24.2%）和43 bp（7.6%），簡約信息位點分別為112 bp（16.5%）和36 bp（6.3%）。

表1 10種紅曲菌的ITS和LSU基因序列信息Table 1 Sequence information of ITS and LSU genes of 10 Monascus species

基于系統(tǒng)發(fā)育的分析方法（一般采用鄰接法）是條形碼研究中常用的方法，其進行物種鑒定的原則是同一物種的所有個體在系統(tǒng)發(fā)育樹中形成單系。利用下載的10種紅曲菌和3種曲霉的ITS和LSU基因序列基于K2P模型進行1 000次自展檢驗構(gòu)建50%多數(shù)一致性系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，用ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，同種紅曲菌所有菌株構(gòu)成的單系的支持率為60%～100%，均大于50%，能明顯被區(qū)分開。只有M.purpureus、M.floridanus和M.mellicola的同種菌株在利用LSU基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中分別聚成單系，且支持率均大于50%。3株M.flavipigmentosus和2株M.recifensis的LSU基因序列分別沒有種內(nèi)變異。M.lunisporasCBS142230和M.lunisporasCBS 113675的LSU基因序列有2 bp的差異，且分別插入到M.recifensis和M.flavipigmentosus的分支中，導(dǎo)致這3種紅曲菌種內(nèi)的菌株沒有按物種分別形成單系。M.lunisporasCBS 142230和2株M.recifensis的LSU基因序列相同。M.sanguineusATCC 200613和M.sanguineusATCC 16436的LSU基因序列完全相同，均與M.purpureus的LSU基因序列只有2 bp的差異，M.sanguineusSICC 3.292與上述2株M.sanguineus在這兩個位點的堿基相同。M.sanguineusSICC 3.292與另外2株M.sanguineus相比，前者具有1 bp缺失和1 bp轉(zhuǎn)換。

從本研究所的紅曲菌種資源庫中選取了52株紅曲菌，BLAST分析顯示這些菌株的ITS和LSU基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫已收錄的紅曲菌屬同一基因的序列沒有差異。

圖1 基于ITS（a）及LSU（b）基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic trees constructed based on ITS (a) and LSU (b) gene sequences

2.2 基于K2P距離法的分析結(jié)果

各種紅曲菌的ITS和LSU基因序列基于K2P模型的種內(nèi)遺傳距離范圍、種內(nèi)平均遺傳距離及種間遺傳距離范圍見表2。由表2可知，對于ITS基因序列，M.argentinensis、M.floridanus和M.pallens無種內(nèi)遺傳距離的計算值，其他紅曲菌種內(nèi)遺傳距離范圍為0～0.014 0，種內(nèi)平均遺傳距離范圍為0～0.014 0；10種紅曲菌種間遺傳距離范圍為0.003 9～0.146 7。對于LSU基因序列而言，M.argentinensis和M.pallens無種內(nèi)遺傳距離的計算值，其他紅曲菌種內(nèi)遺傳距離范圍為0～0.005 3，種內(nèi)平均遺傳距離范圍為0～0.003 5；10種紅曲菌種間遺傳距離范圍為0.001 8～0.051 0。M.lunisporas的ITS基因序列的種內(nèi)遺傳距離明顯高于其他紅曲菌，但M.lunisporas與其他紅曲菌LSU基因序列的種內(nèi)遺傳距離差異并不大。

表2 10種紅曲菌ITS和LSU基因的K2P種間及種內(nèi)遺傳距離Table 2 K2P inter-and intra-specific genetic distances of ITS and LSU genes of 10 Monascus species

10種紅曲菌ITS和LSU基因序列的K2P遺傳距離的比較見表3。由表3可知，M.lunisporas的ITS基因序列最小種間遺傳距離和最大種內(nèi)遺傳距離的比值為1.04，條形碼間隙不明顯；M.purpureus、M.ruber、M.sanguineus、M.flavipigmentosus、M.mellicola和M.recifensis的ITS基因序列的最小種間遺傳距離均明顯大于各自ITS基因序列的最大種內(nèi)遺傳距離，條形碼間隙明顯。對LSU基因序列而言，M.ruber和M.lunisporas的最小種間遺傳距離均小于各自的最大種內(nèi)遺傳距離；M.recifensis的最小種間遺傳距離為0.001 8，最大種內(nèi)遺傳距離為0，但2株M.recifensis與M.lunisporasCBS 142230的LSU基因序列相同。因此這3種紅曲菌LSU基因序列的條形碼間隙不明顯。M.purpureus、M.sanguineus、M.floridanus、M.flavipigmentosus和M.mellicola的LSU基因序列的最大種內(nèi)遺傳距離均明顯小于各自LSU基因序列的最小種間遺傳距離，條形碼間隙明顯。

分別比較了同種紅曲菌的ITS和LSU基因序列的最小種間遺傳距離和最大種間遺傳距離結(jié)果見表3。由表3可知，每種紅曲菌ITS基因序列的最小種間遺傳距離均明顯大于同種紅曲菌LSU基因序列的最小種間遺傳距離，其比值范圍為1.39～14.11；每種紅曲菌ITS基因序列的最大種間遺傳距離均明顯大于同種紅曲菌LSU基因序列的最大種間遺傳距離，其比值范圍為2.32～4.78。最小及最大種間遺傳距離的比較表明不同紅曲菌ITS基因的種間差異均大于該種紅曲菌LSU基因的種間差異。一段DNA序列需滿足以下兩個條件才有可能被作為DNA條形碼：用通用引物易在大多數(shù)或全部目標(biāo)類群中擴增；種間變異高，種內(nèi)變異低，存在條形碼間隙[21]。用通用引物均易在紅曲菌中擴增ITS和LSU基因。遺傳距離的比較表明，除M.lunisporas的ITS基因外，其他紅曲菌的ITS和LSU基因的種內(nèi)變異低（最大種內(nèi)遺傳距離均低于0.7%）；同種紅曲菌ITS基因的種間變異均高于其LSU基因的種間變異。

表3 10種紅曲菌ITS和LSU基因的K2P遺傳距離的比較Table 3 Comparison of K2P genetic distances of ITS and LSU genes of 10 Monascus species

DNA條形碼研究除了采用系統(tǒng)發(fā)育的分析方法，也常用基于K2P模型的遺傳距離法，其進行物種鑒定的準(zhǔn)則是“遺傳距離閾值”與“條形碼間隙”。HEBERT P D N等[9，22]在基于細(xì)胞色素氧化酶C亞基I（cytochrome C oxidase subunit I，COI）的研究中將2%作為遺傳距離閾值，并建議種間平均遺傳距離至少是種內(nèi)平均遺傳距離的10倍以上。但部分物種COI的遺傳距離并不符合2%的閾值標(biāo)準(zhǔn)[23]。對真菌的ITS基因而言，一般采用3%作為遺傳距離閾值，但該閾值并不合適所有真菌[10，24-25]，如同屬子囊菌門（Ascomycota）的煙曲霉（Aspergillus fumigatus）和鹿角炭角菌（Xylaria hypoxylon）的ITS基因的種內(nèi)遺傳距離分別為0.2%和24.2%[24]，差異極大。本研究表明，M.lunisporas的ITS基因的種內(nèi)遺傳距離明顯高于其他紅曲菌。因為不同的基因具有不同的進化速率，不同物種的進化有快慢，對所有物種的所有基因采用某一固定的遺傳距離閾值是不盡合理的。對條形碼間隙而言，有學(xué)者認(rèn)為采用遺傳距離的平均值來構(gòu)建條形碼間隙是不合理的，因為平均值是對整個研究群體遺傳距離的折中，應(yīng)比較最小種間遺傳距離與最大種內(nèi)遺傳距離是否形成明顯的條形碼間隙[23]。只要該物種的最小種間遺傳距離明顯大于其最大種內(nèi)遺傳距離即可，前者不一定要為后者的10倍以上[21，26]。分布廣泛的物種若采樣的地理范圍不完備，則可能低估種內(nèi)遺傳距離；若未包含某一研究類群中盡可能多的不同物種，則會高估種間遺傳距離（真正的最小種間遺傳距離需依據(jù)真正的姐妹群的相同基因序列來計算）[26]。本研究包括了紅曲菌屬現(xiàn)階段公認(rèn)的所有物種（從而可以得到真正的最小種間遺傳距離），并包括了同一種紅曲菌的多個菌株，在此基礎(chǔ)上比較不同紅曲菌ITS和LSU基因的最小種間遺傳距離與最大種內(nèi)遺傳距離。

3 結(jié)論

同種紅曲菌同一基因的最小種間遺傳距離與最大種內(nèi)遺傳距離的比較表明，具有ITS基因種內(nèi)遺傳距離的紅曲菌，除M.lunisporas外，其他紅曲菌ITS基因的條形碼間隙明顯；具有LSU基因種內(nèi)遺傳距離的紅曲菌，除M.ruber、M.lunisporas和M.recifensis外，其他紅曲菌LSU基因的條形碼間隙明顯。利用ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹能明顯區(qū)分各種紅曲菌。只有M.purpureus、M.floridanus和M.mellicola的同種菌株在利用LSU序列構(gòu)建的鄰接樹中分別聚成單系，且支持率均大于50%。因此ITS基因在紅曲菌的分類鑒定中優(yōu)于LSU基因，LSU基因在紅曲菌物種鑒定中的分辨力有限。