馬甲子總?cè)频腍PLC指紋圖譜建立、聚類分析和主成分分析及含量測(cè)定

陳旺 詹雁 王美慧 譚鐳 徐超群

摘 要 目的：建立馬甲子總?cè)频闹讣y圖譜，進(jìn)行聚類分析和主成分分析，并測(cè)定其中主要成分馬甲子素的含量。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）。色譜柱為Agilent PheHex，流動(dòng)相為甲醇-0.05%磷酸水溶液（梯度洗脫），檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。以馬甲子素為參照，繪制10批馬甲子總?cè)频腍PLC指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰;采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行聚類分析和主成分分析。采用同一HPLC法測(cè)定馬甲子素的含量。結(jié)果：10批馬甲子總?cè)乒灿?個(gè)共有峰，相似度均大于0.990;指認(rèn)馬甲子素1個(gè)特征峰。聚類分析結(jié)果顯示，10批馬甲子總?cè)茦悠房删蹫?類，其中S1為一類、S2為一類、S3～S6為一類、S7～S10為一類。主成分分析結(jié)果顯示，前2個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為99.430%。綜合評(píng)分由高到低依次為S1>S9>S8>S7>S10>S2>S3>S5>S6>S4。馬甲子素檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為33.7～844.0 μg/mL（r=0.999 9）;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（24 h）試驗(yàn)的RSD均小于2%，平均加樣回收率為99.75%（RSD=1.13%，n=6）;10批馬甲子總?cè)茦悠分旭R甲子素的平均含量為0.576%～0.712%。結(jié)論：所建HPLC指紋圖譜和含量測(cè)定方法穩(wěn)定、可靠，可用于馬甲子的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 馬甲子總?cè)?馬甲子素;高效液相色譜法;相似度評(píng)價(jià);聚類分析;主成分分析;指紋圖譜;含量測(cè)定

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish fingerprint of Paliurus ramosissimus total triterpenes， and to conduct cluster analysis and principal component analysis， and to determine the content of the main component paliurusene. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent PheHex column with mobile phase consisted of methanol-0.05% phosphoric acid solution （gradient eluetion） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 320 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 5 μL. Using paliurusene as reference， HPLC fingerprints of 10 batches of? ? ? P. ramosissimus total triterpenes were drawn. Similarity evaluation was performed by using TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2012 edition）， and the common peaks were confirmed. Cluster analysis and principle component analysis were performed by using SPSS 26.0 software. The content of paliurusene was determined by same HPLC method. RESULTS： There were totally 6 common peaks in HPLC fingerprint of 10 batches of P. ramosissimus total triterpenes. The similarity was more than 0.990; one of six common peaks was identified as paliurusene. The results of cluster analysis showed that 10 batches of samples could be clustered into 4 categories， including S1， S2， S3-S6 and S7-S10. The results of principal component analysis showed that the accumulative variance contribution rate of primary 2 principal components was 99.430%. Comprehensive score ranking was S1>S9>S8>S7>S10>S2>S3>S5>S6>S4. The linear range of paliurusene concentration was 33.7-844.0 μg/mL（r=0.999 9）. RSDs of precision， reproducibility and stability （24 h） tests were all lower than 2%. Average recovery was 99.75%（RSD=1.13%，n=6）. The average contents of paliurusene in 10 batches of P. ramosissimus total triterpenes was 0.576%-0.712%. CONCLUSIONS： Established HPLC fingerprint and content determination method are reliable and stable， and can be used for the quality control of P. ramosissimus.

KEYWORDS? ?Paliurus ramosissimus total triterpenes;? Paliurusene; HPLC; Similarity evaluation; Cluster analysis; Principal component analysis; Fingerprint; Content determination

中圖分類號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）02-0201-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.02.13

馬甲子為鼠李科植物馬甲子屬馬甲子Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir的葉，在《中華本草》[1]和《中藥大辭典》[2]中均有記載。其性平、味苦，無毒，具有祛風(fēng)濕、消腫止痛、解毒等功效，可用于治療風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、咽喉腫痛、癰疽潰膿等癥[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道，馬甲子主要含有三萜類、黃酮類、環(huán)肽生物堿類等成分[4-6]，具有抗腫瘤、抗炎、抗?jié)?、?zhèn)咳祛痰等作用[7-10]。韋國(guó)鋒等[10]研究發(fā)現(xiàn)，馬甲子乙醇提取物的止咳祛痰效果優(yōu)于馬甲子水提物。何穎等[11]發(fā)現(xiàn)，馬甲子葉醇提物的正丁醇部位能顯著降低角叉膠致胸膜炎模型大鼠體內(nèi)的丙二醛（MDA）、前列腺素E2（PGE2）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）水平，具有明顯的抗炎作用。本課題組前期對(duì)馬甲子總?cè)祁惢衔锛兓に囈约吧锘钚匝芯康慕Y(jié)果顯示，其植株中所含的五環(huán)三萜類衍生物群是該藥產(chǎn)生體外抗腫瘤活性的關(guān)鍵化合物，因此對(duì)馬甲子總?cè)苹衔镞M(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)是保證其藥理活性的關(guān)鍵[12-15]。目前，關(guān)于馬甲子的研究多集中在新劑型[16-18]、藥理作用[8-11]以及農(nóng)業(yè)園藝[19-22]等方面，有關(guān)其化學(xué)成分的研究相對(duì)較少;此外，目前尚無馬甲子總?cè)频馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且該藥材尚未被2020版《中國(guó)藥典》或相關(guān)藥品標(biāo)準(zhǔn)收錄?；诖?，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了馬甲子總?cè)频闹讣y圖譜，并進(jìn)行聚類分析和主成分分析;同時(shí)檢測(cè)其主要成分馬甲子素[7]的含量，旨在為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

分析所用儀器為：Agilent 1260 型HPLC儀（包括二極管陣列檢測(cè)器、二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器及配套液相色譜工作站，美國(guó)Agilent公司）、XS205 DualRange型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、SB5200D型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）、玻璃層析柱（成都市凌云玻璃儀器廠，規(guī)格3.3 cm×60 cm）、AB-8型大孔吸附樹脂（粒徑300～1 250 mm，滄州寶恩吸附材料科技有限公司）等。

1.2 藥品與試劑

所用藥品與試劑為：馬甲子素對(duì)照品（成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)20150801，純度≥98%）、馬甲子總?cè)品勰ㄓ蒘11馬甲子藥材按前期研究方法[15]制得，得率為0.60%，馬甲子素含量為1.269 2%，用于含量測(cè)定方法學(xué)考察）等;甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為純凈水。

11批馬甲子藥材（編號(hào)S1～S11），經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院舒光明研究員鑒定為鼠李科馬甲子屬馬甲子P. ramosissimus（Lour.）Poir的鮮葉。樣品信息來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 馬甲子總?cè)艸PLC指紋圖譜的建立

2.1.1 供試品溶液的制備 取10批藥材（編號(hào)S1～ S10），按前期研究方法[15]制得馬甲子總?cè)品勰ㄆ骄寐蕿?.60%）。取上述馬甲子總?cè)品勰?.1 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理10 min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取馬甲子素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.8? mg/mL的對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱中避光密封保存，備用。

2.1.3 色譜條件 以Agilent PheHex（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）為色譜柱;以甲醇（A）-0.05%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～30 min，0→74%A;30～50 min，74%A→100%A）;檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm;流速為1 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為5 μL。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1）適量，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。以馬甲子素峰為參照（S），計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，6個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.056%～0.108%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為0.089%～2.308%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1）適量，分別于室溫下避光放置 0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以馬甲子素峰為參照（S），計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，6個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.037%～0.184%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為0.066%～2.330%（n=6），表明供試品溶液于室溫下避光放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同法制備的馬甲子總?cè)品勰ň幪?hào)S1）0.1 g，共6份，精密稱定，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以馬甲子素峰為參照（S），計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，6個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.089%～0.223%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為0.078%～2.381%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.7 馬甲子總?cè)艸PLC指紋圖譜的建立 取同法制備的10批馬甲子總?cè)品勰ň幪?hào)S1～S10），按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，得到馬甲子總?cè)茦悠返寞B加指紋圖譜，詳見圖1。

2.1.8 相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》對(duì)10批馬甲子總?cè)茦悠罚ň幪?hào)S1～S10）的指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，采用多點(diǎn)校正方法對(duì)各色譜峰進(jìn)行全峰匹配，生成馬甲子總?cè)茖?duì)照?qǐng)D譜（圖1中的“R”曲線）。結(jié)果，10批樣品相似度均大于0.990，詳見表2。

2.1.9 共有峰指認(rèn) 根據(jù)馬甲子總?cè)频腍PLC疊加指紋圖譜生成結(jié)果，得到6個(gè)共有峰;通過與馬甲子素對(duì)照品色譜圖（圖2A）進(jìn)行對(duì)比，指認(rèn)4號(hào)峰為馬甲子素。因馬甲子素色譜峰分離度較好、峰面積較大，故以其為參照峰（S）計(jì)算其余共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見表3、表4。

2.2 聚類分析

將10批馬甲子總?cè)品勰悠罚ň幪?hào)S1～S10）指紋圖譜中的6個(gè)共有峰峰面積經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用SPSS 26.0 軟件，以組間平均數(shù)連接法、平方Euclideam距離為度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類分析。結(jié)果，10批馬甲子總?cè)茦悠房删蹫?類，其中S1聚為一類、S2聚為一類、S3～S6聚為一類、S7～S10聚為一類，詳見圖3。

2.3 主成分分析

采用SPSS 26.0 軟件對(duì)10批馬甲子總?cè)茦悠返?個(gè)共有峰標(biāo)準(zhǔn)化的峰面積進(jìn)行主成分分析。結(jié)果，共提取了2個(gè)主成分，這2個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為99.430%，提示其可以反映馬甲子總?cè)茦悠分械拇蟛糠中畔?，詳見?。

采用SPSS 26.0軟件對(duì)6個(gè)共有峰標(biāo)準(zhǔn)化的峰面積進(jìn)行因子載荷矩陣。結(jié)果，第1主成分特征值為4.004，方差貢獻(xiàn)率為66.725%;成分3、4（馬甲子素）、5、6在第1主成分上有較高載荷，表明第1主成分主要反映了這4個(gè)成分的信息。第2個(gè)主成分特征值為1.962，方差貢獻(xiàn)率為32.705%，累積方差貢獻(xiàn)率為99.430%，主要反映成分1、2的信息，詳見表5、表6。

主成分載荷矩陣（也稱主成分系數(shù)）不等同于因子載荷矩陣，其可通過因子載荷矩陣計(jì)算得到，根據(jù)表6結(jié)果按公式計(jì)算，Ui=Ai/λ[23]（式中，Ui為主成分系數(shù)，Ai為因子載荷矩陣，λ為特征值），結(jié)果見表7。

每一個(gè)載荷量表示主成分與對(duì)應(yīng)變量（標(biāo)準(zhǔn)化后的峰面積，以A表示）的系數(shù)，第1主成分的線性關(guān)系式為Y1=0.164A1+0.279A2+0.492A3+0.468A4+0.489A5+0.442A6，第2主成分的線性關(guān)系式為Y2=0.671A1+0.586A2+0.122A3-0.251A4-0.143A5-0.330A6;綜合得分（Y）=（66.725%×Y1+32.705%×Y2）/99.430%;綜合得分越高，表示質(zhì)量越好[24]。結(jié)果，10批樣品中，重慶潼南（S1）最優(yōu)，四川德陽羅江縣（S9）和四川彭州（S8）較佳，詳見表8。

2.4 馬甲子素的含量測(cè)定

2.4.1 溶液的制備 取“1.2”項(xiàng)下馬甲子總?cè)品勰┻m量，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，以甲醇為空白溶液。

2.4.2 色譜條件 色譜條件同“2.1.3”項(xiàng)。

2.4.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液、空白溶液（甲醇）、供試品溶液適量，按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，各色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)以馬甲子素計(jì)均不低于5 000，詳見圖2。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.4.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為33.7、84.4、168.8、422.0、844.0 μg/mL的線性工作溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，馬甲子素的回歸方程為Y=3 266.8X+0.732 8（r=0.999 9），表明馬甲子素檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為33.7～844.0 μg/mL。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取“2.4.1”項(xiàng)下供試品溶液適量，按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，馬甲子素峰面積的RSD為0.79%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取“1.2”項(xiàng)下馬甲子總?cè)品勰?.1 g，精密稱定，共6份，按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果，馬甲子素含量的RSD為1.02%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.1”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置 0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，馬甲子素峰面積的RSD為0.31%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 取“1.2”項(xiàng)下馬甲子總?cè)品勰?.1 g，共6份，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入“2.4.4”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為844 μg/mL的線性工作溶液10 mL，按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表9。

2.4.9 樣品含量測(cè)定 取10批同法制備的馬甲子總?cè)茦悠?，按?.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定（平行測(cè)定3次），記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表10。

3 討論

本研究前期對(duì)Agilent SB-C18（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）、Agilent PheHex（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）、Agilent PheHex（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）等不同色譜柱的分離效果進(jìn)行了考察。結(jié)果，以Agilent PheHex（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）為色譜柱時(shí)的色譜峰峰形、分離度均較好，出峰數(shù)量較多，色譜信息較全面，故選擇Agilent PheHex（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）為色譜柱。同時(shí)，本課題組還比較了乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.05%磷酸水溶液等流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果，以甲醇-0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，各色譜峰出現(xiàn)時(shí)間適宜且峰形對(duì)稱、分離度好、基線漂移小，故選擇甲醇-0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。此外，本研究采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)不同檢測(cè)波長(zhǎng)（210、230、260、290、320、350、380 nm）進(jìn)行了考察。結(jié)果，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm處時(shí)，各色譜峰分離度較好，響應(yīng)值較高且馬甲子素峰在此波長(zhǎng)下有較大吸收，故選擇320 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究前期發(fā)現(xiàn)，廣西桂林全州縣白寶鎮(zhèn)產(chǎn)馬甲子藥材中的馬甲子素含量相對(duì)較高，故以其為樣品進(jìn)行含量測(cè)定的方法學(xué)考察，對(duì)另外10批樣品進(jìn)行指紋圖譜、聚類分析和主成分分析以及定量測(cè)定。本研究指紋圖譜分析結(jié)果顯示，10批馬甲子總?cè)浦杏?個(gè)共有峰，且相似度均大于0.990。這提示不同來源的馬甲子總?cè)茦悠分械奶卣鞣逵休^高的一致性。通過與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)4號(hào)峰為馬甲子素。聚類分析結(jié)果顯示，10批馬甲子總?cè)茦悠房删蹫?類，其中S1聚為一類、S2聚為一類、S3～S6聚為一類、S7～S10聚為一類。主成分分析結(jié)果顯示，2個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為99.430%，可代表馬甲子總?cè)茦悠分讣y圖譜的大部分信息;其中，重慶潼南柏梓鎮(zhèn)、四川德陽羅江縣、四川彭州天彭鎮(zhèn)等地區(qū)產(chǎn)馬甲子藥材的綜合質(zhì)量較好。10批馬甲子總?cè)茦悠分旭R甲子素的平均含量為0.576%～0.712%，以重慶潼南柏梓鎮(zhèn)產(chǎn)馬甲子的馬甲子素含量最高，其他地區(qū)藥材樣品中馬甲子素含量有所差異，可能與不同產(chǎn)地的環(huán)境、氣候及采收時(shí)間有關(guān)[25]。

綜上所述，所建HPLC指紋圖譜和含量測(cè)定方法穩(wěn)定、可靠，可用于馬甲子藥材的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2020-09-17 修回日期：2020-12-04）

（編輯：陳 宏）