丹參-石菖蒲中活性成分丹參素與細(xì)辛醚的相關(guān)性*

唐一梅，余 雙，陳慶慶，2，秦 蓓，張德柱，王曉茹

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，藥物研究所，陜西 西安 710021；2.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，四川 成都 610500；3.陜西盤龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，陜西 西安 710025；4.陜西功能食品工程中心有限公司，陜西 西安 710065)

“石菖蒲-丹參”開竅醒腦，活血化瘀，但目前文獻(xiàn)報(bào)道的“石菖蒲-丹參”組方多為臨床實(shí)踐總結(jié)，對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)的研究報(bào)道很少。

鄭曉暉教授課題組研究了使藥冰片[1]、郁金[2]、檀香[3]、丹皮[4]、降香[5]等對(duì)君藥丹參藥代動(dòng)力學(xué)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使藥對(duì)君藥具有增效作用。于潔等[6]研究石菖蒲和丹參配伍后，石菖蒲對(duì)丹參藥代動(dòng)力學(xué)的影響。結(jié)果表明，石菖蒲和丹參配伍后，可以促進(jìn)丹參在大鼠血液中的吸收程度和速度，增加君藥丹參的生物利用度。

離子液體是一種新型的溶劑[7]，具有熱穩(wěn)定性好、蒸氣壓低、溶解能力強(qiáng)、可設(shè)計(jì)性等優(yōu)點(diǎn)[8]，已用于有機(jī)合成[9-10]、電化學(xué)[11]、生物工程[12]、萃取分離[13-18]等領(lǐng)域。研究以離子液體為輔助溶劑，丹參素、α-細(xì)辛醚為檢測(cè)指標(biāo)，干預(yù)使藥中有效成分的提取量，得到的使藥提取液作為溶劑提取分析君藥有效成分提取量的變化。從分子水平上，闡明君藥與使藥配伍之后的物質(zhì)基礎(chǔ)變化是密切相關(guān)的，兩者作用源于有效成分之間存在的相互作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑與儀器

1-甲基-3-丁基-咪唑溴([BMIM]Br),1-甲基-3-辛基咪唑溴離子液體([OMIM]Br)：自制；六氟磷酸鉀：化學(xué)純，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；丹參素對(duì)照品：純度≥98%，批號(hào)KJ0622CA14，上海源葉生物科技有限公司；α-細(xì)辛醚對(duì)照品：純度≥98%，批號(hào)R27J7Y1678，上海源葉生物科技有限公司；甲醇：色譜純，美國Fisher公司；甲酸：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；丹參：唇形科植物丹參的干燥根及根莖；石菖蒲：天南星科菖蒲屬石菖蒲的干燥根莖，均經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室汪興軍老師鑒定，分別粉碎，過篩(孔內(nèi)徑：250 μm±9.9 μm)，待用。

高效液相色譜儀：G1312B型1260，美國Agilent公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；超聲波清洗器：SB-5200DT型，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試品溶液的制備

1.2.1.1 丹參提取液的制備

稱取丹參粉末3 g置100 mL圓底燒瓶中，加8倍量的水，浸泡30 min，回流提取2次，每次1.5 h，提取完成后趁熱抽濾，合并濾液；用體積比75%甲醇定容至100 mL，得到提取液樣品；精密移取1.00 mL樣品溶液，用75%甲醇溶液定容至10 mL容量瓶。

稱取丹參粉末3 g置100 mL圓底燒瓶中，加8倍量的水與2.67 mL[BMIM]Br離子液體浸泡30 min，回流提取2次，每次1.5 h，提取完成后趁熱抽濾，合并濾液；濾液加入2.77 g六氟磷酸鉀(KPF6)于40 ℃水浴60 min除去離子液體，離心取上清液定容至100 mL；精密移取1.00 mL樣品溶液，用75%甲醇定容至10 mL容量瓶。

稱取丹參粉末3 g置100 mL圓底燒瓶中，先加入2.67 mL[BMIM]Br離子液體浸泡30 min，再加入8倍量的水，回流提取2次，每次1.5 h，提取完成后趁熱抽濾，合并濾液；濾液加入2.77 g KPF6于40 ℃水浴60 min除去離子液體，離心取上清液定容至100 mL；精密移取1.00 mL樣品溶液，用75%甲醇定容至10 mL容量瓶。

1.2.1.2 石菖蒲提取液的制備

稱取石菖蒲粉末1.5 g置100 mL圓底燒瓶中，加入8倍量的水浸泡2 h，回流提取2 h，提取完成后趁熱抽濾，得石菖蒲水提取液；提取液用75%甲醇定容置50 mL，得石菖蒲水體液供試品溶液。

稱取石菖蒲粉末1.5 g置100 mL圓底燒瓶中，加入8倍量的水與0.6 mL[OMIM]Br離子液體浸泡2 h，回流提取2 h，提取完成后趁熱抽濾；濾液加入0.49 g KPF6于40 ℃水浴60 min除去離子液體，離心取上清液，得石菖蒲離子液體-水提取液；提取液用75%甲醇定容至50 mL的容量瓶，得供試品溶液，得石菖蒲離子液體-水供試品溶液。

稱取石菖蒲粉末1.5 g置100 mL圓底燒瓶中，先加入0.6 mL[OMIM]Br離子液體浸泡2 h，再加入8倍量的水，回流提取2 h，提取完成后趁熱抽濾；濾液加入0.49 g KPF6于40 ℃水浴60 min除去離子液體，離心取上清液，得石菖蒲離子液體(浸泡2 h后)-水提取液；用75%甲醇定容至50 mL的容量瓶，得石菖蒲離子液體(浸泡2 h后)-水供試品溶液。

1.2.1.3 丹參-石菖蒲提取液的制備

按1.2.1.2方法得到的3種石菖蒲提取液補(bǔ)足至固液質(zhì)量比1∶8，加入到3 g丹參中，回流提取2次，每次1.5 h，提取完成后趁熱抽濾，合并濾液，用75%甲醇定容至100 mL，得到丹參-石菖蒲提取液樣品；精密移取1.00 mL樣品溶液，用75%甲醇溶液定容至10 mL容量瓶。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取α-細(xì)辛醚對(duì)照品1.0 mg，丹參素對(duì)照品5.0 mg用75%甲醇定容至25 mL容量瓶中，得到ρ(α-細(xì)辛醚)=0.04 mg·mL、ρ(丹參素)=0.2 mg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.3 色譜條件

Agilent HC-C18(4.6×150 mm,5 μm)色譜柱；HPLC分析條件：流動(dòng)相為甲醇-水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%甲酸)線性梯度洗脫：0～9 min，20∶80；9～12 min，50∶50；12～22 min，70∶30；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長：286 nm。

1.4.4 線性范圍

吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00 mL用75%甲醇至10 mL容量瓶，得到ρ(丹參素)=5、10、15、20、30、40 μg/mL與ρ(α-細(xì)辛醚)=2、4、6、8、12、16 μg·mL的混合對(duì)照品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，分別精密吸取10 μL進(jìn)樣，記錄質(zhì)量濃度和峰面積。以峰面積A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度c為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，得丹參素線性回歸方程A=6.0984c-31.5(r=0.994 0)，α-細(xì)辛醚線性回歸方程A=18.939c-18.05(r=0.999)。結(jié)果表明，丹參素在5～40 μg/mL、ρ(石菖蒲)=2～16 μg/mL線性關(guān)系良好。

2 結(jié)果與討論

根據(jù)《中國藥典》2015版附錄《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》要求，采用外標(biāo)法測(cè)定供試品中待測(cè)成分的含量，方法學(xué)考察符合測(cè)定要求，結(jié)果見表1。

表1 不同溶劑及提取方式對(duì)有效成分得率的影響

2.1 離子液體加入方式對(duì)丹參素、α-細(xì)辛醚的影響

以水、離子液體-水為溶劑提取劑時(shí)，獲得丹參、石菖蒲供試品溶液分析結(jié)果，見圖1。

不同溶劑體系

由表1、圖1可知，當(dāng)用水-離子液體混合溶劑提取時(shí)，丹參素的得率明顯高于水提取的丹參素的得率，石菖蒲中α-細(xì)辛醚的得率也高于水提取的得率，且離子液體浸泡后加水再浸泡后提取，有效成分得率均高于離子液體-水混合浸泡的得率。

離子液體浸泡后加水提取，應(yīng)分2種情況，(1)離子液體浸泡(超聲)后直接加水提??；(2)離子液體浸泡后加水再浸泡。這2種情況結(jié)果不同，純離子液體浸泡目的在于離子液體能夠溶解纖維素、破除細(xì)胞壁，利于有效成分釋放。當(dāng)離子液體溶解了纖維素、破除細(xì)胞壁后，再繼續(xù)用離子液體-水溶劑浸泡，目的是利于有效成分更好轉(zhuǎn)移到溶劑體系中。因此，在一些文獻(xiàn)中出現(xiàn)離子液體浸泡后，提取獲得有效成分反而低于離子液體-水混合后浸泡有效成分的提取得率[19]。

總之，離子液體的加入，有效成分提取得率提高，這與離子液體的獨(dú)特屬性有關(guān)，具有很好的傳質(zhì)作用，破壞了植物的細(xì)胞壁，從而加速藥材中有效成分的溶出[20]。

2.2 不同溶劑種類對(duì)丹參素以及α-細(xì)辛醚得率的影響

丹參-石菖蒲混合供試品溶液分析結(jié)果，見圖2。

不同溶劑體系

由表1、圖2可知，丹參素的得率在提取劑為水-石菖蒲(離子液體浸泡后加水)提取液的條件下最高，提取劑為水-石菖蒲(離子液體水混合)提取液得率次之，水-石菖蒲提取液進(jìn)行提取時(shí)得率最低。

相反，當(dāng)水-石菖蒲提取液為提取溶劑時(shí)所得的混合溶液中α-細(xì)辛醚的得率最高。分析其原因可能由于加入離子液體的石菖蒲提取液再對(duì)丹參進(jìn)行提取時(shí)因?yàn)橐綦x子液體時(shí)進(jìn)行的40 ℃水浴時(shí)導(dǎo)致石菖蒲中揮發(fā)性成分有所損失。

2.3 不同溶劑對(duì)丹參素得率的影響

丹參不同提取方式，供試品溶液測(cè)試結(jié)果，見圖3。

不同溶劑體系

由圖3可知，當(dāng)提取液中有石菖蒲時(shí)，所得的丹參素得率均比沒有石菖蒲有效成分時(shí)的得率要高，分析其原因可能由于石菖蒲中的有效成分與丹參素有弱的相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致丹參素的得率增加。由表1可知，α-細(xì)辛醚的量相對(duì)減少，可能是石菖蒲中提取液中其他有效成分增加，這些有效成分與丹參素有著弱的相互作用力，從而導(dǎo)致丹參素得率增加。通過研究，表明單一檢測(cè)α-細(xì)辛醚的量不足以表明君-使藥對(duì)之間的作用機(jī)制。石菖蒲的有效成分主要為揮發(fā)性成分，其中一部分溶于水的小分子可能與丹參素有著弱的相互作用力，從而導(dǎo)致丹參素的得率增加。

總之，離子液體作為一種表面活性劑，本身就有著傳統(tǒng)溶劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，作為綠色溶劑，離子液體能破除細(xì)胞壁，破壞纖維素使有效成分溶出。

君-使藥對(duì)構(gòu)成的藥對(duì)體系是一個(gè)復(fù)雜的物質(zhì)體系，配伍之后之所以能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，從化學(xué)的角度分析，這與藥對(duì)配伍之后在分子水平上的物質(zhì)基礎(chǔ)變化是密切相關(guān)的，其本質(zhì)原因是君藥和使藥在體內(nèi)各自有組效應(yīng)物質(zhì)，這2組效應(yīng)物質(zhì)之間協(xié)同作用，加上機(jī)體的調(diào)和作用，從而起到相應(yīng)的療效。

3 結(jié) 論

研究充分說明石菖蒲中的揮發(fā)性成分可能與丹參素有著弱的相互作用力，這能夠闡明“君-使”對(duì)藥引經(jīng)、增效實(shí)質(zhì)，為研究復(fù)方配伍規(guī)律的體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理，開發(fā)高效創(chuàng)新藥物提供新參考。