保健食品多種礦物質(zhì)維生素咀嚼片中泛酸鈣含量測定的不確定度評定

田京歌，馮有龍

（江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇南京 210019）

泛酸又稱遍多酸或維生素B5，是一種水溶性維生素，是輔酶A和酰基載體蛋白生物合成的重要前體物質(zhì)，參與生物體內(nèi)碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)和能量代謝，但游離泛酸對熱、酸和堿均不穩(wěn)定[1-2]，因此工業(yè)應(yīng)用通常使用穩(wěn)定性好的衍生物——泛酸鈣。泛酸鈣通常作為一種營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加于多種食品和保健食品中，以補(bǔ)充泛酸攝入的缺失，保證人體正常的新陳代謝，保健食品作為一種特殊的食品，越來越引起人們的重視。

測量不確定度可以合理的表征測量結(jié)果的范圍區(qū)間，并關(guān)系著合格結(jié)論的判定，可以更好地評價(jià)測量結(jié)果的準(zhǔn)確度[3-5]。泛酸鈣作為一種重要的營養(yǎng)補(bǔ)充劑，準(zhǔn)確測定其含量可以更好地評價(jià)保健食品的質(zhì)量。目前文獻(xiàn)報(bào)道多是關(guān)于食品中泛酸含量測定的不確定度評定[6-7]，未見有保健食品中泛酸鈣含量測定的不確定度評定。本文參考《保健食品中泛酸鈣的測定》（GB/T 22246—2008）[8]，采用高效液相的方法測定了生命力牌多種維生素礦物質(zhì)咀嚼片中泛酸鈣的含量，為了評價(jià)泛酸鈣測定結(jié)果的準(zhǔn)確度，提高檢測水平，本試驗(yàn)依據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）和 CNAS-CL006：2019 化學(xué)分析中不確定度的評估指南程序?qū)Σ淮_定度來源進(jìn)行了分析[9-10]，參考相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]，計(jì)算不確定度各分量，并合成結(jié)果，以此來評價(jià)各個(gè)因素對測定結(jié)果的影響，進(jìn)而提高檢測水平，控制檢測質(zhì)量，同時(shí)為其他相關(guān)不確定度評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泛酸鈣（批號100370-201903，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%）來源于中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，Merck公司）；磷酸二氫鉀（分析純，國藥集團(tuán)有限公司）；磷酸（色譜純，阿拉丁公司）；水為去離子水（經(jīng)Milli-Q水處理系統(tǒng)得到）；生命力牌多種維生素礦物質(zhì)咀嚼片（江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院提供）。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260，DAD檢測器）；超聲波清洗器（型號為KH-250DB，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；電子天平（型號CPA224S，賽多利斯）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為ACE 5 Excel 5 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH=3.0）-乙腈=95∶5；檢測波長為200 nm，流速1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.2 溶液的制備

（1）對照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備。稱量泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品約0.1 g（精確至0.000 1 g），置于100 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混勻。

（2）對照品標(biāo)準(zhǔn)使用液的制備。精密量取泛酸鈣儲(chǔ)備液5 mL置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。吸取0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL和8.00 mL泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)使用液（相當(dāng)于 2.5 μg、5.0 μg、10.0 μg、20.0 μg、40.0 μg和80.0 μg泛酸鈣），分別置于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。在給定的儀器條件下，進(jìn)行色譜分析，以峰面積對濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（4）供試品溶液的制備。稱取0.3 g粉碎后的均勻試樣（精確到0.001 g），使試樣濃度位于標(biāo)準(zhǔn)曲線中。試樣置于25 mL容量瓶中，加水20 mL，超聲處理20 min后，加水至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，即得。

1.3.3 數(shù)學(xué)模型的建立

試樣中泛酸鈣的含量計(jì)算如下：

式中：X-試樣中泛酸鈣的含量，單位為g/100 g；C-由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得進(jìn)樣液中泛酸鈣的濃度，單位為μg/mL；V-試樣定容體積，單位為mL；m-試樣的質(zhì)量，單位為g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據(jù)檢測過程和數(shù)學(xué)模型分析，泛酸鈣含量測定相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（X）的來源主要有以下幾個(gè)方面，具體見圖1。其不確定度的來源包括：供試品的稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（Mt）、供試品的定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（Vt）、供試品的重復(fù)測定引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（Rp）、方法回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（Rc）、供試品溶液的濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（C），其中ur（C）來源于對照品儲(chǔ)備溶液的制備過程、對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液制備過程、標(biāo)準(zhǔn)曲線因素等。

圖1 不確定度來源分析圖

2.2 不確定度評定

2.2.1 供試品的稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（rMt）

CPA224S型天平為萬分之一天平（d=0.1 mg），檢定證書的最大允差為±0.000 5，按照矩形分布，k=，稱取供試品2份，減重法稱重，2次的稱樣量分別為0.305 1 g，0.302 4 g。則稱樣量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為則供試品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur（Mt）=

2.2.2 供試品的定容體積引入的相對不確定度ur（Vt）

本次試驗(yàn)中所用的玻璃儀器的容量允許誤差引入的不確定度均按B類不確定度進(jìn)行評定，容量瓶的體積變化相對液體可以忽略，只考慮液體的膨脹引入的不確定度，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，實(shí)驗(yàn)室溫度控制在（20±5） ℃，服從矩形分布，則環(huán)境溫度變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為試驗(yàn)采用25 mL的容量瓶，由國家計(jì)量檢定規(guī)程JJG 196—2006[13]查得其容量允差±0.030 mL，則其引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為則

2.2.3 供試品的重復(fù)測定引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（rRp）

在檢測過程中，測量重復(fù)性引入的不確定度包括了各種隨機(jī)因素，如人員實(shí)驗(yàn)操作熟練程度、儀器性能等，該不確定度屬于A類不確定度，平行制備12份供試品溶液，按照“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行12次測定，泛酸鈣的含量分別為0.297 g/100 g、0.285 g/100 g、0.301 g/100 g、0.308 g/100 g、0.308 g/100 g、0.287 g/100 g、0.298 g/100 g、0.300 g/100 g、0.292 g/100 g、0.302 g/100 g、0.287 g/100 g和 0.291 g/100 g，測得重復(fù)測量（n=12）的平均值為=0.296 g/100 g，標(biāo)準(zhǔn)偏差SD（Rp）=0.007 935，則重復(fù)測量產(chǎn)生的相對不確定度為

2.2.4 方法回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（Rc）

按照低、中、高3種濃度水平（m=3）進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，使待測樣品量與加入對照品的量比例分別為1.0∶1.0、1.0∶0.5、1.0∶1.5，每種濃度制備3份供試品，計(jì)算方法回收率，結(jié)果分別為94.8%、93.7%、95.2%、95.4%、96.5%、93.7%、94.8%、98.2%和92.3%，方法回收率不確定度屬于A類不確定度，平均回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差SD（Rc）為1.71%，則回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為采用t檢驗(yàn)的方法來分析方法平均回收率與回收率100%之間是否有顯著性差異，以此判斷是否需要用回收率對計(jì)算結(jié)果進(jìn)行修正，而在自由度為8，置信概率為95%下，t0.95（8）=2.31，因t＞2.31，故本試驗(yàn)中需要用回收率來修正計(jì)算結(jié)果，則供試樣品中泛酸鈣的實(shí)際含量

2.2.5 供試品溶液的濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（C）

（1）對照品儲(chǔ)備溶液的濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（C0）。對照品儲(chǔ)備溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度由對照品純度和稱量等因素引入。泛酸鈣對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，說明書中對照品純度為96.8%，未注明不確定度值，暫假設(shè)其純度為96.8%±0.05%，服從矩形分布（），則對照品純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

對照品稱量引入的不確定度由天平的最大允差計(jì)算，采用的為萬分之一天平（d=0.1 mg），檢定證書的最大允差為±0.000 5，按照矩形分布采用減重法稱重，稱取對照品量為0.101 6 g，故天平稱重引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

對照品儲(chǔ)備液配制過程中使用的是100 mL的容量瓶，其為A級，查得其容量允差為±0.10 mL，按矩形分布，則玻璃器皿引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為因環(huán)境溫度變化而引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為合成對照品儲(chǔ)備液配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

將上述不確定度分量合成，得到對照品儲(chǔ)備溶液的濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur（C0）=

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（V0）。本試驗(yàn)中由對照品儲(chǔ)備液配制對照品工作溶液，之后配制成標(biāo)曲系列濃度，均會(huì)采用玻璃量具，包含刻度吸管、容量瓶等，按照國家計(jì)量檢定規(guī)程的要求，都有相應(yīng)的允差，按照矩形分布計(jì)算，k=，由此來計(jì)算所采用的玻璃器皿的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量，具體見表1。

表1 玻璃器皿引入的不確定度

則標(biāo)曲各溶液配制過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（C1）。本試驗(yàn)中系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.3.1色譜條件分別測定1次，結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)曲溶液測定結(jié)果

其 中， 斜 率a=13.693 5， 截 距b=1.851 3，則擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線峰面積A殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差為為測定次數(shù)，n=6。

對供試品溶液重復(fù)測定12次，p=12，計(jì)算得到供試品中泛酸鈣的含量為則ur(C1)為：

將以上不確定度分量合成得到ur（C）

2.3 合成不確定度及擴(kuò)展不確定度

綜上分析，本試驗(yàn)中高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定生命力牌多種維生素礦物質(zhì)咀嚼片中泛酸鈣含量的各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量見表3。

表3 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

將上述不確定度合成得到合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

本試驗(yàn)中測得供試品中泛酸鈣的實(shí)際含量為Xt=0.312 g/100 g，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

取包含因子為k=2，置信概率為95%，則擴(kuò)展不確定度為：U=2×Uh(X1) =2×0.004 671=0.0093 g/100 g，因此，HPLC法測定生命力牌多種維生素礦物質(zhì)咀嚼片中泛酸鈣含量的結(jié)果可表示為：（0.312±0.009 3） g/100 g，k=2（95% 的置信區(qū)間）。

3 結(jié)論與討論

本文對采用HPLC法測定保健食品多種維生素礦物質(zhì)咀嚼片中泛酸鈣的含量進(jìn)行了不確定度評定，通過計(jì)算各個(gè)相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，可以推測得出試驗(yàn)中不確定度的來源主要是標(biāo)曲溶液的配制，其次是樣品測定的重復(fù)性，方法回收率及對照品儲(chǔ)備溶液濃度的影響，最后是標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合及供試品稱量及定容體積的影響。因此，在以后的試驗(yàn)測定中要加強(qiáng)對以上影響因素的控制，改進(jìn)試驗(yàn)方法，盡可能減少試驗(yàn)誤差，提高檢測數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

測量不確定度是完整試驗(yàn)數(shù)據(jù)的一部分，最終得到的擴(kuò)展不確定度即是測量結(jié)果在一定置信水平上的置信區(qū)間[14-15]。本試驗(yàn)以多種維生素礦物質(zhì)咀嚼片中泛酸鈣含量測定為例，對測量結(jié)果進(jìn)行了不確定度評定，可以為其他保健食品中功效成分含量測定的評定和相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供參考。