蓖麻L(zhǎng)BD基因家族全基因組鑒定、進(jìn)化和表達(dá)分析

段 強(qiáng)，何智彪，李國(guó)瑞，趙秀平，張 帥，韓雯毓，陳永勝

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 蓖麻育種國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古通遼 028043；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所應(yīng)用光學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130000；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028043；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 通遼 028043；5.內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，內(nèi)蒙古 通遼 028043；6.蓖麻產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新內(nèi)蒙古自治區(qū)工程研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028043；7.通遼市農(nóng)牧科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 通遼 028043）

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）是一類能夠以序列特異性方式結(jié)合DNA 的蛋白質(zhì)分子，通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平指導(dǎo)基因表達(dá)，在各種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。LBD（lateral organ boundaries domain）是一類具有LOB（lateral organ boundaries）結(jié)構(gòu)域的植物特有的轉(zhuǎn)錄因子基因家族[1]，也稱作AS2/LOB 基因，這類基因家族在植物的側(cè)生組織原基中特異性表達(dá)。LBD 基因參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育與代謝過(guò)程并在其中起著重要作用，包括植物響應(yīng)激素、營(yíng)養(yǎng)元素、生物和非生物脅迫以及植物側(cè)生器官發(fā)育、氮素營(yíng)養(yǎng)的吸收代謝、次生代謝等[2]。

LBD 通常包含4 個(gè)高度保守的半胱氨酸基序CX2CX6CX3C（C 為保守的半胱氨酸殘基、X 為不保守的氨基酸殘基），這是LBD 家族最明顯的特征[3]。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)一些LBD 含有甘氨酸組成的GAS 基序和類亮氨酸拉鏈基序LX6LX3LX6L。根據(jù)這些保守結(jié)構(gòu)域，將LBD 轉(zhuǎn)錄因子家族分為兩個(gè)亞家族Class 1 和Class 2[3]。當(dāng)前已經(jīng)明確了一些LBD 基因的功能，但仍有部分基因的功能尚待驗(yàn)證。在擬南芥中，AtLBD4 以及CHALFUN-JUNIOR 等[4]研究發(fā)現(xiàn)的AtLBD41 基因參與調(diào)控植物葉片發(fā)育。LBD 中的另一成員AtAS2 基因，在幼嫩花器官近軸面特異表達(dá)，從而調(diào)控植物的花器官發(fā)育[5-7]。SCHEIBLE 等[8]和RUBIN 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中第2 類LBD 成員AtLBD37、AtLBD38、AtLBD39 以及ALBINSKY 等[10]在水稻中發(fā)現(xiàn)的OsLBD37 基因參與調(diào)控氮素代謝。ZENTELLA 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，赤霉素抑制LBD 成員AtASL37 的表達(dá)；而IKEZAKI 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，LBD的另一成員AtAS2 基因能夠促進(jìn)赤霉素合成。BERCKMANS 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtLBD33 和AtLBD18 基因能夠通過(guò)激活E2Fa 的表達(dá)，促進(jìn)側(cè)根發(fā)育。楊樹中與擬南芥AtLBD1 同源的LBD1 基因，能夠與抑制物SRDX 結(jié)構(gòu)域平移融合，降低直徑增長(zhǎng)，抑制韌皮部的發(fā)育，調(diào)控次生生長(zhǎng)[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，AtLBD16、AtLBD17、AtLBD18 和AtLBD29 是誘導(dǎo)愈傷組織初始體形成的關(guān)鍵調(diào)控因子，抑制LBD 基因表達(dá)會(huì)阻止愈傷組織的形成。

蓖麻（Ricinuscommunis）為大戟科（Euphorbiaceae）蓖麻屬（Ricinus）一年生或多年生灌木。與大多數(shù)大戟科植物類似，蓖麻的適應(yīng)能力特別強(qiáng)。2010年，蓖麻基因組草圖的繪制使其成為大戟科第1 個(gè)完成基因組測(cè)序的物種[15]；2021年，蓖麻基因組組裝至染色體水平，為通過(guò)比較基因組學(xué)在染色體水平研究蓖麻耐脅迫的分子機(jī)制創(chuàng)造了條件[16]。本研究基于組裝至染色體水平的蓖麻基因組對(duì)蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族進(jìn)行全面鑒定，并在此基礎(chǔ)上分析其基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系及表達(dá)模式，旨在為解析蓖麻L(zhǎng)BD基因家族功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

綠蓖1 號(hào)、淄蓖5 號(hào)種子來(lái)自內(nèi)蒙古通遼市農(nóng)牧科學(xué)研究所，在實(shí)驗(yàn)室中種植于田園土∶蛭石∶營(yíng)養(yǎng)土=1∶2∶1 的基質(zhì)中。隨機(jī)選擇生長(zhǎng)三葉期的蓖麻植株幼苗為試驗(yàn)材料，以噴施正常濃度除草劑（90 g/hm2）——25%砜嘧磺隆的2 種蓖麻群體為處理組；以未加除草劑處理，噴施等量清水的2 種蓖麻群體為對(duì)照組。每個(gè)處理隨機(jī)取樣4 株，采取每單株的葉片、莖段、根部分，將樣品記為綠蓖1 號(hào)處理組（LB_T）、綠蓖1 號(hào)對(duì)照組（LB_C），淄蓖5 號(hào)處理組（ZB_T）、淄蓖5 號(hào)對(duì)照組（ZB_C），每組織部位設(shè)置4 次重復(fù)，分別命名為L(zhǎng)1～L4、S1～S4、R1～R4。放入液氮冷凍，置-80 ℃保存。后續(xù)對(duì)處理組和對(duì)照組樣品進(jìn)行處理，包括總RNA 的提取、純化，cDNA 文庫(kù)構(gòu)建，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及相關(guān)分析等。

1.2 數(shù)據(jù)來(lái)源

本研究中，蓖麻全基因組序列、蛋白質(zhì)序列、編碼序列與注釋文件來(lái)自O(shè)il Plant Database（http：//oilplants.iflora.cn），擬南芥LBD 基因家族的基因與蛋白質(zhì)序列獲取于TAIR 數(shù)據(jù)庫(kù)（Araport11，https：//www.arabidopsis.org/），麻瘋樹獲取于NCBI（RJC1_Hi-C，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），玉米獲取于NCBI（B73 RefGen_v4.0，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），水稻獲取于NCBI（Build 4.0，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），番茄獲取于NCBI（SL3.0，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），煙草獲取于NCBI（Ntab-TN90，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），蓖麻的相關(guān)表達(dá)量數(shù)據(jù)來(lái)自Gene Expression Omnibus Database（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）。

1.3 蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族成員鑒定及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

使用蓖麻蛋白質(zhì)序列文件在本地建立數(shù)據(jù)庫(kù)，以擬南芥全部的43 個(gè)LBD 基因家族成員序列作為query 序列進(jìn)行本地BLASTP 比對(duì)（E-value≤1e-10）[17]。由Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org/）獲得LBD 基因家族典型結(jié)構(gòu)域的隱馬爾科夫模型（PF03195），以此為query 序列進(jìn)行本地HMMER 比對(duì)[18]。將BLASTP 與HMMER 比對(duì)結(jié)果進(jìn)行匯總，去除冗余序列。分別使用NCBI CDD 工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/） 與EBI InterPro 工具（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）對(duì)候選序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域檢測(cè)[19-20]，使用Clustal Omega 軟件進(jìn)行多重比對(duì)[21]，使用Jalview 可視化比對(duì)結(jié)果[22]，手動(dòng)剔除結(jié)構(gòu)域缺失與不完整的序列，對(duì)于同一基因存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本的情況，選擇第1 個(gè)轉(zhuǎn)錄本作為代表序列，從而確定蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族的成員。通過(guò)ExPASy 的ProtParam 工具（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)已確定的蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)分析[23]，同時(shí)使用Plant-mPLoc 進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位[24]。

1.4 蓖麻L(zhǎng)BD 基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)保守基序分析

利用蓖麻基因組注釋文件，通過(guò)編寫的腳本提取LBD 基因家族成員的基因、內(nèi)含子與外顯子位點(diǎn)信息，并計(jì)算內(nèi)含子與外顯子長(zhǎng)度。使用MEME 在線工具（http：//meme-suite.org/tools/meme）對(duì)蓖麻L(zhǎng)BD 蛋白進(jìn)行保守基序分析[25]，基序數(shù)目設(shè)置為10 個(gè)，通過(guò)編寫的腳本提取保守基序的位點(diǎn)信息。蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族的結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)保守基序均使用Evoview 在線工具進(jìn)行可視化[26]。使用SWISS-MODEL在線工具對(duì)具有代表性的蓖麻L(zhǎng)BD 蛋白進(jìn)行同源三維建模[27]。

1.5 蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族染色體定位及復(fù)制分析

使用Circos 軟件繪制基因在染色體上的分布圖[28]，從而確定在染色體上的位置。使用MCScanX 軟件（http：//chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/） 對(duì)蓖 麻L(zhǎng)BD基因家族在基因組中的復(fù)制模式進(jìn)行分析[29]，同時(shí)對(duì)蓖麻L(zhǎng)BD 與擬南芥LBD 基因進(jìn)行共線性分析，使用本地BLASTP 對(duì)蓖麻與擬南芥的蛋白質(zhì)序列文件進(jìn)行建庫(kù)，以此蛋白質(zhì)序列文件作為query 序列進(jìn)行BLASTP 比對(duì)，設(shè)置E-value 為1e-10。判定相互匹配部分的長(zhǎng)度大于較長(zhǎng)序列長(zhǎng)度的80%且相互匹配部分的相似性大于80%的緊密相連的基因中，只參與1 次復(fù)制事件，同時(shí)結(jié)合基因在染色體上的位置，判斷其復(fù)制類型，蓖麻與擬南芥的種內(nèi)、種間共線性關(guān)系使用Circos 軟件進(jìn)行可視化。使用KaKs_Calculator 2.0 軟件對(duì)復(fù)制基因?qū)M(jìn)行進(jìn)化選擇壓力分析[30]，計(jì)算片段重復(fù)基因?qū)Φ姆峭x替換率（Ka）和同義替換率（Ks）及其比例（Ka/Ks），剔除不符合閾值的基因?qū)?，使用ggplot2 對(duì)符合閾值的基因?qū)Φ姆治鼋Y(jié)果進(jìn)行可視化[31]。

1.6 LBD 基因家族進(jìn)化發(fā)育分析

對(duì)蓖麻L(zhǎng)BD 蛋白質(zhì)序列及擬南芥、麻瘋樹、玉米、水稻、番茄、煙草LBD 蛋白質(zhì)序列進(jìn)行ClustalW多重序列比對(duì)，對(duì)齊保守結(jié)構(gòu)域兩端序列，使用MEGA X 軟件以鄰接法（NJ）構(gòu)建蓖麻種間系統(tǒng)發(fā)育樹，使用PhyML 軟件以最大似然法（ML）構(gòu)建蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育樹[32-33]，最大似然法采用LG+G Model，鄰接法采用JTF Model，設(shè)置Bootstrap 檢驗(yàn)1 000 次，其余采用默認(rèn)參數(shù)，使用Evolview 在線工具對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹可視化[26]。

1.7 蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族表達(dá)模式分析

從NCBI GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取蓖麻不同組織的相關(guān)表達(dá)量數(shù)據(jù)，包括Ⅱ/Ⅲ期胚乳、Ⅴ/Ⅵ期胚乳、萌芽種子、葉片、雄花[34]。非生物脅迫數(shù)據(jù)來(lái)自內(nèi)蒙古民族大學(xué)蓖麻育種國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的前期研究（數(shù)據(jù)未公布），包括經(jīng)過(guò)除草劑噴施與未噴施的蓖麻葉片、莖段和根。使用編寫的腳本對(duì)統(tǒng)計(jì)得到的reads count 值進(jìn)行FPKM標(biāo)準(zhǔn)化處理，在計(jì)算過(guò)程中，將基因所有外顯子的長(zhǎng)度之和定義為有效的基因長(zhǎng)度。為了了解蓖麻L(zhǎng)BD基因家族的表達(dá)模式，對(duì)所有樣本中表達(dá)量為0 的基因進(jìn)行剔除，并對(duì)剩余的蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族進(jìn)行層次聚類。使用R-4.1.0 軟件（https：//www.r-project.org/） 的Pheatmap 包進(jìn)行基因表達(dá)量熱圖繪制（https：//cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/）[35]，為使結(jié)果更加準(zhǔn)確，對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓖麻L(zhǎng)BD基因家族成員鑒定及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

為確定蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族成員，分別進(jìn)行了本地BLASTP 與HMMER 比對(duì)，由TAIR 獲取了擬南芥LBD 基因家族成員的蛋白質(zhì)序列，以此作為query 序列進(jìn)行本地BLASTP 比對(duì)，結(jié)果顯示，有33 條符合閾值的蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族候選序列（E-value≤1e-10）；經(jīng)確認(rèn)，LBD 典型結(jié)構(gòu)域的Pfam 登記號(hào)為PF03195，下載其隱馬爾科夫模型，經(jīng)本地HMMER比對(duì)也獲得33 條符合閾值的候選序列（圖1）。使用NCBI CDD 與EBI InterPro 工具對(duì)候選序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域檢測(cè)，使用Clustal Omega 進(jìn)行多重序列比對(duì)，手動(dòng)剔除類鋅指結(jié)構(gòu)CX2CX6CX3C 缺失或不完整的序列，從而確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)于同一基因存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本的情況，選擇第1 個(gè)轉(zhuǎn)錄本作為代表序列；最后，共鑒定得到30 個(gè)蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族成員，按照基因在染色體上的順序命名為RcLBD1～RcLBD30。對(duì)蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族成員進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估，包括基因長(zhǎng)度、氨基酸數(shù)目、蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)、亞細(xì)胞定位等。由表1 可知，30 個(gè)蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族的氨基酸數(shù)目與分子量差異較小，但有個(gè)別成員差異較大，其中，RcLBD29 只有73 個(gè)氨基酸數(shù)目，分子量最小，為8 513.10 D；RcLBD12 則有1 486 個(gè)氨基酸數(shù)目，分子量最高，為166 377.47 D。等電點(diǎn)范圍波動(dòng)較大，其中，RcLBD21 等電點(diǎn)最低，為4.53；RcLBD29 等電點(diǎn)最高，為9.72。除RcLBD29 外，疏水系數(shù)（grand average of hydropathy，GRAVY）均為負(fù)值，表明其他蓖麻L(zhǎng)BD 蛋白均為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，30 個(gè)蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族的蛋白質(zhì)全部位于細(xì)胞核內(nèi)，RcLBD12 既位于細(xì)胞核內(nèi)也位于細(xì)胞膜中。

表1 蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族信息

圖1 蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族的序列特征

2.2 蓖麻L(zhǎng)BD 基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)保守基序分析

為探究蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族的基因結(jié)構(gòu)，基于注釋文件，使用編寫的腳本進(jìn)行了基因結(jié)構(gòu)分析，30 個(gè)蓖麻L(zhǎng)BD 基因的外顯子、內(nèi)含子分布情況見圖2。由圖2 可知，30 個(gè)蓖麻L(zhǎng)BD 基因的外顯子數(shù)目為2～7 個(gè)，內(nèi)含子數(shù)目為1～7 個(gè)。其中，RcLBD12 與RcLBD28 含有7 個(gè)外顯子和內(nèi)含子，RcLBD10 含有5 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子，RcLBD25 含有4 個(gè)外顯 子和3 個(gè)內(nèi)含子，RcLBD5、RcLBD8、RcLBD14、RcLBD20、RcLBD24 均含有3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子，而RcLBD17 僅含有1 個(gè)外顯子并沒(méi)有內(nèi)含子，除此以外，其他所有成員均含有2 個(gè)外顯子和1 個(gè)內(nèi)含子。

基序，亦稱模序、模體，是指DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子中的保守序列，是介于二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的另一種結(jié)構(gòu)層次。MEME 分析結(jié)果顯示，30 個(gè)蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族成員中共找到10 個(gè)Motif（圖2），僅前5 個(gè)Motif 的E-value 小于0.05，單個(gè)成員含有的Motif 范圍在1～6 個(gè)。其中，所有成員均具有Motif2， 經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，Motif2為類鋅指結(jié)構(gòu)CX2CX6CX3C，這也是LBD 基因家族的標(biāo)志；絕大多數(shù)成員同時(shí)具有Motif1 與Motif3，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)Motif1 為GAS 基序，Motif3 為類亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)LX6LX3LX6L。值得注意的是，RcLBD7 具有Motif2與Motif3 而缺失了Motif1，RcLBD29 僅具有Motif2并且第1 個(gè)半胱氨酸突變?yōu)樘於０?，更有趣的是，RcLBD4、RcLBD6、RcLBD11、RcLBD14、RcLBD18、RcLBD27 均缺失了Motif3，而在相同位點(diǎn)以Morif4（LLWSGNWHVCQAAVETVLRGGPIRPL）取代?？梢悦黠@看出，蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族擁有較為簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)保守基序結(jié)構(gòu)，與對(duì)應(yīng)的基因結(jié)構(gòu)基本一致。

圖2 蓖麻L(zhǎng)BD 基因的種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育樹、基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守基序

為進(jìn)一步探究蓖麻L(zhǎng)BD 蛋白的結(jié)構(gòu)，使用SWISS-MODEL 對(duì)具有代表性的蓖麻L(zhǎng)BD 蛋白進(jìn)行同源建模（圖3），其中，A 為RcLBD2，屬于Class 1，具有完整的LOB 結(jié)構(gòu)域；B 為RcLBD28，屬于Class 2，缺失類亮氨酸拉鏈；C 為RcLBD29，屬于Class 1，但缺失類亮氨酸拉鏈且GAS 基序不完整。如建模結(jié)果所示，無(wú)論屬于哪個(gè)亞族，蓖麻L(zhǎng)BD 蛋白的空間結(jié)構(gòu)都呈現(xiàn)出近似對(duì)稱的“Y”字結(jié)構(gòu)，但RcLBD29是例外的，RcLBD29 只保留了上部的近似“V”的結(jié)構(gòu)，這意味著RcLBD29 可能在進(jìn)化過(guò)程中丟失了部分功能。

圖3 蓖麻L(zhǎng)BD 蛋白同源建模

2.3 蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族染色體定位及復(fù)制分析

基因在染色體上的分布與染色體在表達(dá)過(guò)程中的參與程度以及在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的重要性密切相關(guān)。為探究蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族的復(fù)制模式與進(jìn)化機(jī)制，進(jìn)行了染色體定位分析，以往蓖麻多在Scafford水平進(jìn)行分析，難以有效地探明其關(guān)系，得益于測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，二代測(cè)序結(jié)合三代測(cè)序已將蓖麻基因組組裝至染色體水平（圖4），30 個(gè)蓖麻L(zhǎng)BD 基因分布在9 條染色體上，在RcChr6 上沒(méi)有分布。此外，除RcLBD7 位于RcChr3 外，其余染色體上均有多個(gè)成員分布，RcChr8 上最多，有7 個(gè)成員分布，分別是RcLBD18～RcLBD24。

通過(guò)對(duì)蓖麻和擬南芥進(jìn)行共線性分析，MCScanX 結(jié)果顯示，在蓖麻中有7 對(duì)同源基因?qū)?，分別是RcLBD4 和RcLBD11、RcLBD6 和RcLBD27、RcLBD7 和RcLBD17、RcLBD9 和RcLBD15、RcLBD11和RcLBD14、RcLBD13 和RcLBD28、RcLBD18 和RcLBD27。對(duì)這些共線性區(qū)域分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在蓖麻的30 個(gè)RcLBD 基因中僅RcLBD19、RcLBD20 為串聯(lián)重復(fù)基因，RcLBD1、RcLBD2 可能來(lái)自小規(guī)模的轉(zhuǎn)座，或者是由某些其他基因的串聯(lián)復(fù)制和插入產(chǎn)生的，RcLBD4、RcLBD6、RcLBD7、RcLBD9、RcLBD11、RcLBD12、RcLBD13、RcLBD14、RcLBD15、RcLBD17、RcLBD18、RcLBD27、RcLBD28 可能來(lái)源于全基因組復(fù)制或片段復(fù)制，其他的RcLBD 基因可能來(lái)自轉(zhuǎn)座，如“復(fù)制型轉(zhuǎn)座”“非復(fù)制型轉(zhuǎn)座”或“保守轉(zhuǎn)座”等。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)6 對(duì)同源基因?qū)Γ謩e是AtLBD1 和AtLBD11、AtLBD10 和AtLBD36、AtLBD16和 AtLBD29、AtLBD37 和 AtLBD38、AtLBD37 和AtLBD39、AtLBD38 和AtLBD39。同時(shí)，蓖麻與擬南芥物種間存在25 對(duì)同源基因?qū)?，主要分布在擬南芥的AtChr1、AtChr3 上，表明了LBD 基因家族的高度保守性?？梢园l(fā)現(xiàn)，LBD 基因家族的部分成員在蓖麻和擬南芥染色體上的排列極為接近，聚集成簇，說(shuō)明在進(jìn)化歷程中可能發(fā)生了大規(guī)模的片段復(fù)制事件。根據(jù)Circos 軟件對(duì)共線性結(jié)果進(jìn)行了可視化，其結(jié)果見圖4。

圖4 蓖麻L(zhǎng)BD 基因染色體定位及共線性分析

蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族進(jìn)化選擇壓力分析表明，所有基因?qū)Φ腒a 值均小于Ks 值，所有Ka/Ks 值均小于0.4（圖5），表明蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了較強(qiáng)的純化選擇，以減少片段重復(fù)后的有害突變。

圖5 蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族進(jìn)化選擇壓力分析

2.4 LBD 基因家族進(jìn)化發(fā)育分析

種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）結(jié)果顯示，30 個(gè)蓖麻L(zhǎng)BD 基因分為2 個(gè)亞族Class 1 和Class 2。亞族Class 1 與Class 2 的成員基序結(jié)構(gòu)都較為簡(jiǎn)單，值得注意的是，亞族Class 1 中RcLBD7 與RcLBD29是特殊的，在Class 1 中除RcLBD7 缺失GAS 基序和RcLBD29 缺失GAS 基序與類亮氨酸拉鏈外，所有的Class 1 成員均具有包含類鋅指結(jié)構(gòu)、GAS 基序與類亮氨酸拉鏈在內(nèi)的完整結(jié)構(gòu)，這可能是在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了丟失。有趣的是，RcLBD13 與RcLBD28 在進(jìn)化上明顯晚于其他蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族成員，二者的類亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯的氨基酸突變。

種間系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）包含30 個(gè)蓖麻L(zhǎng)BD 蛋白、43 個(gè)擬南芥LBD 蛋白、40 個(gè)麻瘋樹LBD 蛋白、45 個(gè)玉米LBD 蛋白、34 個(gè)水稻LBD 蛋白、42 個(gè)番茄LBD 蛋白、92 個(gè)煙草LBD 蛋白。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，7 個(gè)物種共計(jì)326 個(gè)LBD 蛋白被分為2 個(gè)亞族，命名為Class 1 和Class 2，在種間系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，30 個(gè)蓖麻L(zhǎng)BD 蛋白分布于2 個(gè)亞族之中，與種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致。在所有亞族中均含有蓖麻與擬南芥的LBD 蛋白，在Class 2 中也包含6 個(gè)擬南芥LBD 基因家族成員，分別是AtLBD37、AtLBD38、AtLBD39、AtLBD40、AtLBD41 和AtLBD42，這也與擬南芥LBD 基因家族的分類一致，意味著兩者可能在進(jìn)化上比較相似。有趣的是，RcLBD29 在7 個(gè)物種中都是獨(dú)特的，RcLBD29 僅具有1 個(gè)類鋅指結(jié)構(gòu)CX2CX6CX3C、類亮氨酸拉鏈缺失、GAS 基序發(fā)生氨基酸突變，但在進(jìn)化中被歸于Class 1，在1 000 次Bootstrap 檢驗(yàn)的最大似然法樹中自展值為1 000。總的來(lái)看，LBD 基因家族在7 個(gè)物種中高度保守。

圖6 蓖麻L(zhǎng)BD 基因種間系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族表達(dá)模式分析

為研究蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族的表達(dá)模式，探究基因功能，從NCBI GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了蓖麻的表達(dá)量數(shù)據(jù)，包括Ⅱ/Ⅲ期胚乳、Ⅴ/Ⅵ期胚乳、萌芽種子、葉片、雄花，命名為A 組，其結(jié)果見圖7。此外，為了探究蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族在非生物脅迫的功能，對(duì)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蓖麻育種國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了探究（數(shù)據(jù)未公開），包括經(jīng)過(guò)除草劑噴施與未噴施的蓖麻葉片、莖段和根，命名為B 組，其結(jié)果見圖8。

圖7 蓖麻5 個(gè)組織中LBD 基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)

圖8 噴施除草劑后的蓖麻L(zhǎng)BD 基因表達(dá)量數(shù)據(jù)

在A 組數(shù)據(jù)中，蓖麻L(zhǎng)BD 基因在不同組織部位中具有不同的表達(dá)模式，表現(xiàn)出了顯著的組織特異性。大多數(shù)的蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族僅在特定的組織部位中高表達(dá)。有研究顯示，在擬南芥中ASL1基因參與調(diào)控了花的細(xì)胞分化從而調(diào)控花序的發(fā)育進(jìn)程[4]，在蓖麻雄花組織中RcLBD10、RcLBD15、RcLBD16、RcLBD17、RcLBD19、RcLBD20、RcLBD24、RcLBD25、RcLBD28、RcLBD30 高表達(dá)，意味著這些LBD 基因可能參與了蓖麻雄花的形態(tài)建成。在葉片組織中，RcLBD8、RcLBD18、RcLBD22、RcLBD27 高表達(dá)，有研究顯示，在擬南芥中，AtAS2 通過(guò)抑制KNOX 基因表達(dá)來(lái)調(diào)控?cái)M南芥近軸面區(qū)域的細(xì)胞增殖，從而介導(dǎo)兩面對(duì)稱的平展葉形成[36]，AtLBD36 參與調(diào)控了葉的形態(tài)建成[37]，說(shuō)明蓖麻L(zhǎng)BD 基因可能在蓖麻葉片發(fā)育中扮演了重要角色。此外，部分蓖麻L(zhǎng)BD 基因在種子與胚的不同發(fā)育時(shí)期出現(xiàn)高表達(dá)，說(shuō)明蓖麻L(zhǎng)BD 基因在蓖麻發(fā)育前期也起到了重要作用，這與AtLBD30 參與擬南芥胚胎發(fā)生、ZmLBD19 調(diào)控玉米胚珠發(fā)育一致[36，38]。此外，值得注意的是，有7 個(gè)蓖麻L(zhǎng)BD 基因在5 個(gè)組織中均為表達(dá)，分別是RcLBD5、RcLBD9、RcLBD13、RcLBD21、RcLBD23、RcLBD26 和RcLBD29。

在B 組數(shù)據(jù)中，展示了蓖麻受到除草劑砜嘧磺隆噴施后在根、莖、葉3 個(gè)組織部位中響應(yīng)非生物脅迫的狀況，同時(shí)，由于增加了莖段與根的樣本數(shù)據(jù)，對(duì)A 組數(shù)據(jù)來(lái)說(shuō)是一個(gè)有力的補(bǔ)充?？梢悦黠@看出，在蓖麻中絕大多數(shù)的LBD 基因在根中高表達(dá)。有研究表明，在擬南芥中，植物激素調(diào)節(jié)因子ARF 通過(guò)激活A(yù)tLBD16、AtLBD18、AtLBD29 從而調(diào)控了擬南芥的側(cè)根發(fā)育過(guò)程[39-41]，在水稻中，OsCrl11 也參與調(diào)節(jié)了水稻不定根的發(fā)生[42]，這與蓖麻中LBD 基因一致。有研究發(fā)現(xiàn)，TaLBD34、TaLBD54 在受到冷脅迫的小麥中高表達(dá)[43]，GmLBD12 在干旱、鹽脅迫與植物激素誘導(dǎo)的大豆中高表達(dá)[44]。在蓖麻中，RcLBD6、RcLBD16、RcLBD27 在除草劑處理的蓖麻葉片中上調(diào)表達(dá)，其中，RcLBD6 上調(diào)近10 倍、RcLBD27 上調(diào)2 倍；RcLBD6、RcLBD12、RcLBD16、RcLBD23、RcLBD27 在除草劑處理的蓖麻根部中上調(diào)表達(dá)，其中，RcLBD6 上調(diào)3 倍、RcLBD27 上調(diào)2 倍；RcLBD6、RcLBD8、RcLBD14、RcLBD20、RcLBD27、RcLBD28 在除草劑處理的蓖麻莖段中上調(diào)表達(dá)，其中，RcLBD6 上調(diào)5 倍、RcLBD8 上調(diào)7 倍、RcLBD27上調(diào)2 倍。這表明蓖麻L(zhǎng)BD 基因在抵御非生物脅迫的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，并且存在明顯的組織特異性。值得注意的是，RcLBD6 與RcLBD27 在噴施過(guò)除草劑的蓖麻根、莖、葉3 個(gè)部位中均上調(diào)表達(dá)，有趣的是，RcLBD6 和RcLBD29 都與擬南芥AtLBD37、AtLBD38、AtLBD39 基因同源，這些都表明LBD 基因家族可能在植物逆境脅迫中起到了重要作用。此外，蓖麻中Class 1 與Class 2 的LBD 基因家族成員在表達(dá)模式上并沒(méi)有明顯的差別。

3 結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)錄因子普遍存在于高等植物之中，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫等方面發(fā)揮著重要作用，側(cè)生器官邊界域基因LBD 是一類廣泛存在于綠色植物中的特異性轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育與代謝過(guò)程并起著重要作用。

本研究首先在蓖麻中鑒定了33 條LBD 蛋白質(zhì)序列，由于在蓖麻L(zhǎng)BD 基因中存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，對(duì)于同一基因存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本的情況，選擇第1 個(gè)轉(zhuǎn)錄本作為代表序列，在剔除類鋅指結(jié)構(gòu)域缺失與不完整的序列之后，共獲得30 條蛋白質(zhì)序列，并以此作為蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族的成員?；驈?fù)制與進(jìn)化選擇壓力分析顯示，蓖麻與擬南芥LBD 基因家族在進(jìn)化上高度保守，在進(jìn)化歷程中出現(xiàn)了大規(guī)模的片段復(fù)制事件并經(jīng)歷了較強(qiáng)的純化選擇來(lái)減少片段重復(fù)后帶來(lái)的有害突變。蓖麻種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，從基因結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)保守基序來(lái)看，全部的RcLBD 基因被分為2 個(gè)亞族（Class1、Class2），2個(gè)亞族的RcLBD 基因的結(jié)構(gòu)差異較小，但蛋白質(zhì)保守基序差異明顯。從蓖麻與擬南芥、麻瘋樹、玉米、水稻、番茄、煙草的種間系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，7 個(gè)物種共計(jì)326 個(gè)LBD 蛋白被分為2 個(gè)亞族（Class1、Class2），可以看出，種間系統(tǒng)發(fā)育樹與種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育樹有著極高的相似性，LBD 基因家族在進(jìn)化上較為保守。值得注意的是，在進(jìn)化過(guò)程中部分LBD 蛋白的GAS 基序與類亮氨酸拉鏈發(fā)生了氨基酸突變，類似RcLBD13與RcLBD28，可能暗示了一種進(jìn)化趨勢(shì)，此外，RcLBD29 在7 個(gè)物種中都是特殊的，更像是進(jìn)化過(guò)渡階段的產(chǎn)物。表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，蓖麻L(zhǎng)BD基因家族可能在蓖麻的花、葉片、根、胚等組織發(fā)育過(guò)程中起到了重要的作用，RcLBD6 與RcLBD27在噴施過(guò)除草劑的蓖麻根、莖、葉中均上調(diào)表達(dá)且差異顯著，被推測(cè)可能參與了蓖麻響應(yīng)非生物脅迫的過(guò)程。

綜上所述，與以往對(duì)蓖麻的基因家族研究不同，本研究是在染色體水平上進(jìn)行的。本研究采用生物信息學(xué)手段，從全基因組篩選與鑒定了蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族成員，同時(shí)分析了基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)保守基序、進(jìn)化發(fā)育、表達(dá)模式等，研究結(jié)果為解析蓖麻L(zhǎng)BD 基因家族功能奠定了基礎(chǔ)，并為遺傳育種工作提供了參考。