復(fù)方鮮竹瀝液微生物限度檢查法的建立

張靜，張春華，周萍，章瑛，謝茵

江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

復(fù)方鮮竹瀝液為江西省特色中藥制劑，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）2020 年版一部［1］，標(biāo)準(zhǔn)對其微生物限度要求較為嚴(yán)格，需氧菌總數(shù)≤102cfu，霉菌和酵母菌總數(shù)≤10 cfu，并不得檢出大腸埃希菌。復(fù)方鮮竹瀝液處方包括鮮竹瀝、生半夏、魚腥草、枇杷葉、桔梗、生姜、薄荷素油等七味藥材，用于痰熱咳嗽，痰黃黏稠等。該制劑為合劑，含有豐富的維生素和水分，pH 在4.8～6.0 之間，處方中又加入蔗糖或甜菊素等微生物生長所需的物質(zhì)，環(huán)境極易于微生物的生長和繁殖。制劑的微生物污染程度，對制劑的有效性、穩(wěn)定性和安全性都產(chǎn)生重大的影響，也直接關(guān)系到臨床用藥的安全［2-4］。鑒于復(fù)方鮮竹瀝液的使用較廣，生產(chǎn)企業(yè)較多，有必要對其微生物污染狀況進(jìn)行研究，建立適用于不同企業(yè)的微生物限度檢查方法，為復(fù)方鮮竹瀝液的用藥安全和質(zhì)量控制提供參考。本研究選擇了江西省內(nèi)6 家生產(chǎn)企業(yè)共計9 批次復(fù)方鮮竹瀝進(jìn)行方法學(xué)考察及驗(yàn)證。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

YXQ-LS-50S Ⅱ高壓蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)醫(yī)療器械有限公司），Sartorius T601-L 電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），SW-CJ-2D 凈化工作臺（蘇州凈化有限公司），PYX-DHS 細(xì)菌培養(yǎng)箱、MJ-160B 霉菌培養(yǎng)箱、PYX-DHS 隔水式恒溫培養(yǎng)箱（均為上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

1.2 培養(yǎng)基與菌種

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（北京三藥科技開發(fā)有限公司，批號：20200324），胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號：191104），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號：20200310），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號：20200310），麥康凱液體培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司，批號：20190927），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司，批號：20191121），4-甲基傘形酮葡糖苷酸-蛋白胨培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司，批號：20191124）。上述培養(yǎng)基進(jìn)行適用性檢查，生長能力、抑制能力及指示特性均符合實(shí)驗(yàn)要求。

菌種均來自中國食品藥品檢定研究院。使用菌種信息如下：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］，白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］，黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］，大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］。以下使用菌種均按《中國藥典》2020 年版要求稀釋制備，做活菌計數(shù)備用。

1.3 樣品

抽取江西省內(nèi)6 家生產(chǎn)廠家，包括江西南昌濟(jì)生制藥有限責(zé)任公司3 批（規(guī)格：10 mL、20 mL，150 mL），江西遠(yuǎn)東藥業(yè)股份有限公司1 批（規(guī)格：10 mL），江西濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司2 批（規(guī)格：10 mL、20 mL），江西匯仁藥業(yè)股份有限公司1 批（規(guī)格：10 mL），江西天施康中藥股份有限公司1 批（規(guī)格：10 mL），江西九華藥業(yè)有限公司1 批（規(guī)格：10 mL），共計9 批次復(fù)方鮮竹瀝液。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

建立樣品的微生物限度檢查法時，首先需進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于該樣品的微生物限度檢查，也就是確認(rèn)樣品在一定的檢驗(yàn)量和一定的檢驗(yàn)條件下無抗菌活性或抗菌活性在該條件下被消除到可以忽略不計，盡可能地去除或者中和抗菌活性，以保證本檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠和檢驗(yàn)方法的完整度。實(shí)驗(yàn)參照《中國藥典》2020 年版四部通則1105（微生物計數(shù)法）、1106（控制菌檢查法）［7］進(jìn)行試驗(yàn)，以確定復(fù)方鮮竹瀝液的微生物限度檢查方案的完整建立［5-7］。

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

樣品包含混勻的樣品原液和1∶10 供試液。取樣品10 mL，置錐形瓶中，加90 mL pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液混勻，作為1∶10 供試液。

按如下公式計算加菌回收比值：

2.1.1 需氧菌總數(shù)計數(shù)法 試驗(yàn)組：取混勻的樣品原液9.9 mL 和1∶10 供試液9.9 mL，分別加入適宜濃度的試驗(yàn)菌液0.1 mL，混勻，使每1 mL 供試液中含菌量≤100 cfu。取1 mL 注入平皿，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，置30～35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h～ 72 h，每隔24 h 觀察一次結(jié)果。供試品對照組：取上述制備好的原液和1∶10 供試液，以pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，同試驗(yàn)組操作，測定供試品本底菌數(shù)。菌液對照組：取相應(yīng)pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液0.1 mL，混勻，后續(xù)操作同試驗(yàn)組。

2.1.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)法 試驗(yàn)組：取混勻的樣品原液9.9 mL，加入適宜濃度的試驗(yàn)菌液0.1 mL，混勻，使每1 mL供試液中含菌量≤100 cfu。取1 mL注入平皿，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置20～25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h～120 h,每隔24 h 觀察一次結(jié)果。供試品對照組和菌液對照組參照“2.1.1”項(xiàng)下制備，培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置20～25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h～120 h，每隔24 h 觀察一次結(jié)果。

2.1.3 大腸埃希菌檢查法 試驗(yàn)組：取1∶10 供試液10 mL 加入100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同時加入＜100 cfu的大腸埃希菌液，置35 ℃培養(yǎng)18 h～24 h，取上述培養(yǎng)物1 mL 接種至100 mL 麥康凱液體培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)24～48 h 后取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，35 ℃培養(yǎng)18～72 h，取麥康凱瓊脂平板上菌落經(jīng)純化后的培養(yǎng)物，接種至含5 mL 4-甲基傘形酮葡糖苷酸-蛋白胨培養(yǎng)基的試管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5 h、24 h 在366 nm 波段處紫外線下觀察，同時用未接種的4-甲基傘形酮葡糖苷酸-蛋白胨培養(yǎng)基作空白對照。觀察后，沿管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液再觀察。陰性對照組：取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL 照大腸埃希菌檢查法操作。

2.2 結(jié)果

根據(jù)《中國藥典》2020 年版四部通則1105（微生物計數(shù)法），需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法學(xué)驗(yàn)證需三次獨(dú)立平行的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果判定為回收比值均在0.5～2 之間；控制菌檢查方法為能有所加菌落的典型特征反應(yīng)來判定。

9 批次復(fù)方鮮竹瀝液經(jīng)過驗(yàn)證：需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)在三次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中各種菌落的回收比值均在0.8～1.3 之間，符合《中國藥典》2020 年版四部通則1105（微生物計數(shù)法）判定要求，見表1。大腸埃希菌檢查亦能見所加菌落的典型反應(yīng)，見表2。

表1 平行試驗(yàn)中菌落的回收比值

表2 大腸埃希菌檢查法方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

6 家企業(yè)的9 批次樣品，經(jīng)過試驗(yàn)最后確定微生物限度檢查法略有不同。

其中8 批次樣品方法為：取樣品原液按平皿法（1 mL/皿），依法測定需氧菌總數(shù)；取樣品原液按平皿法（1 mL/皿），依法測定霉菌和酵母菌總數(shù)；取1∶10 供試液10 mL 至100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，依法檢查大腸埃希菌。1 批次樣品方法為：取1∶10 供試液按平皿法（1 mL/皿），依法測定需氧菌總數(shù)；取樣品原液按平皿法（1 mL/皿），依法測定霉菌和酵母菌總數(shù)；取1∶10 供試液10 mL 至100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，依法檢查大腸埃希菌。同一企業(yè)不同規(guī)格的樣品方法一致。結(jié)果見表3。

表3 微生物限度檢查方法

3 討論

復(fù)方鮮竹瀝液為中藥液體口服制劑，其本身并無抑菌性，容易受微生物污染而導(dǎo)致藥物變質(zhì)，處方中通常加有一定量抑菌劑以保持制劑在保質(zhì)期內(nèi)不受微生物入侵?！吨袊幍洹?020 年版一部收載的復(fù)方鮮竹瀝液制法中明確指出1 000 mL的復(fù)方鮮竹瀝液中加入3 g 苯甲酸鈉，抑菌劑濃度為0.3%。經(jīng)查閱企業(yè)的處方資料，6 家企業(yè)的復(fù)方鮮竹瀝液均加入一定量的抑菌劑苯甲酸鈉。復(fù)方鮮竹瀝液微生物限度檢查方法的略有不同有可能為企業(yè)制備時添加抑菌劑苯甲酸鈉的濃度不一致導(dǎo)致。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同生產(chǎn)企業(yè)的樣品，微生物限度檢查法略有差異，體現(xiàn)在需氧菌總數(shù)檢查方面，兩種方法分別樣品原液和1∶10 供試液。方法的差異與復(fù)方鮮竹瀝液處方中加入的抑菌劑濃度有關(guān)，與樣品的規(guī)格無關(guān)。