無(wú)尾果中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量測(cè)定研究

葛文輝，趙敏敏,，高燕平，游媛，任琦，蔡靖波

1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004

植物無(wú)尾果（Coluria longifoliaMaxim.）為薔薇科無(wú)尾果屬，產(chǎn)于我國(guó)西藏、青海、甘肅、云南、四川地區(qū)，是我國(guó)常用藏藥熱袞巴藥材原植物之一，具有止血止痛、清熱作用［1-2］。無(wú)尾果植物中含有黃酮類化合物、木脂素類化合物、三萜類化合物、植物甾醇類化合物等，可鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱，用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療［3-10］。目前，對(duì)無(wú)尾果的研究報(bào)道甚少，且無(wú)相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本文以槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷為指標(biāo)成分,運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，建立可用于無(wú)尾果內(nèi)在質(zhì)量控制的有效方法。

1 材料

1.1 儀器

戴安Ultimate 3000 系列高效液相色譜儀（美國(guó)賽默飛公司），Sartorius BP211D 型電子天平（德國(guó)賽托利斯集團(tuán)），ML-204T 電子天平（梅特勒-托利多）。

1.2 試藥

無(wú)尾果藥材（貴州，批號(hào)：20201027、1907139、1907157、20200805、20200806、2020、DY），槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷（批號(hào)：CFS202101，98%）對(duì)照品購(gòu)自ChemFaces，乙腈為色譜純，水為純凈水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（15∶85）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖見圖1～3。

圖1 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品HPLC色譜圖

圖2 供試品溶液HPLC色譜圖

圖3 甲醇空白HPLC色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 稱適量槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻得到對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取無(wú)尾果粉末（批號(hào)：20201027，過(guò)四號(hào)篩）約0.25 g，精密稱定。取甲醇50 mL，放入錐形瓶?jī)?nèi)一同稱重，在水浴鍋上加熱回流30 min，冷卻后再稱重，用相同試劑補(bǔ)重，搖勻后進(jìn)行過(guò)濾，續(xù)濾液為供試品溶液。

2.2.3 空白樣品溶液 取甲醇溶液作為空白樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 用十萬(wàn)分之一天平精密稱取槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品8.66 mg，置10 mL的量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即為對(duì)照品溶液的母液。再將母液稀釋14 倍后制成稀釋液，按以上色譜條件分別吸取稀釋液1 μL，2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，12 μL 進(jìn)行峰面積的測(cè)定。以吸取量X（μg）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積Y 為縱坐標(biāo)，繪制槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程式：Y=1 064.9X+1.545 5，r=0.999 7，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷在0.061 9～0.742 3 μg 之間線性關(guān)系良好。對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖4 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 批號(hào)相同的無(wú)尾果樣品取6 份，每份重約0.5 g，通過(guò)以上相同的制備方法和色譜條件得到6份無(wú)尾果供試品溶液并對(duì)其分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算無(wú)尾果中黃酮苷類成分槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量的RSD 為0.6%。說(shuō)明無(wú)尾果樣品按此法進(jìn)行試驗(yàn)，有良好重復(fù)性。

2.3.3 耐用性試驗(yàn) 將無(wú)尾果重復(fù)性試驗(yàn)其中的2 份供試品溶液，用SVEA、YMC、資生堂三種不同品牌的C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱按以上色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種品牌C18 色譜柱的測(cè)定結(jié)果并無(wú)明顯差異。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 根據(jù)以上色譜條件將無(wú)尾果藥材的供試品溶液持續(xù)6 次取樣，每次10 μL，對(duì)其峰面積進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算RSD 為0.43%。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h不同時(shí)間內(nèi)，分別吸取同份無(wú)尾果藥材的供試品溶液10 μL，記錄槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的峰面積，得其峰面積的RSD=0.23%，表明24 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 取已知含量的無(wú)尾果藥材粉末（過(guò)四號(hào)篩）6 份，每份約0.125 g，精密稱定。加入槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品1.5 mg，按以上制備方法和色譜條件得無(wú)尾果供試品溶液并對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的回收率。結(jié)果顯示其平均回收率（n=6）為101.5%，RSD 為2.0%，回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品含量測(cè)定

按以上制備方法和色譜條件得到不同批次無(wú)尾果藥材的供試品溶液，并且分別進(jìn)行峰面積測(cè)定，根據(jù)測(cè)定數(shù)據(jù)計(jì)算出無(wú)尾果中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 無(wú)尾果中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品溶液，空白為甲醇溶液，紫外吸收波長(zhǎng)在200～400 nm 范圍內(nèi)對(duì)槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)最大吸收波長(zhǎng)為353 nm，參照文獻(xiàn)報(bào)道選擇360 nm，結(jié)合樣品360 nm 波長(zhǎng)下雜峰對(duì)目標(biāo)峰無(wú)干擾且穩(wěn)定，故以360 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 提取方法的考察

取樣品粉末（批號(hào)為：20201027）2 份，各約0.25 g，放入錐形瓶，用胖肚吸管量取50 mL 甲醇，置瓶中，將其進(jìn)行稱重，分別用超聲（功率250 W，頻率25 kHz）和加熱回流2 種不同的提取方法，時(shí)間均為30 min，取出放冷后再次稱重，缺少的重量滴加甲醇補(bǔ)足，搖勻后進(jìn)行過(guò)濾，供試品溶液為續(xù)濾液。采用以上色譜條件，發(fā)現(xiàn)加熱回流提取方法所得溶液的槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量較超聲提取方法高，故選擇加熱回流提取方法。

3.3 溶劑用量考察

取同一批樣品3 份，各約0.25 g，倒入錐形瓶，用胖肚吸管分別吸取25 mL、50 mL、75 mL 純甲醇至錐形瓶中，稱重，均加熱回流30 min，取出放冷后再次稱重，純甲醇補(bǔ)重，震蕩均勻后過(guò)濾，供試品溶液為續(xù)濾液，根據(jù)以上色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，加入甲醇50 mL 和75 mL 提取槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸無(wú)明顯差異，故選擇提取溶劑用量為50 mL。

3.4 提取溶劑的考察

取同一批樣品3 份，各約0.25 g，放入4 個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)，分別用胖肚吸管取乙醇、50%甲醇、70%甲醇和甲醇50 mL，加入到錐形瓶，稱重，回流提取30 min，取出放冷后再次稱重，分別用相對(duì)應(yīng)濃度的試劑進(jìn)行補(bǔ)重，震蕩后過(guò)濾，取其續(xù)濾液為供試品溶液。采用以上色譜條件，分別進(jìn)行測(cè)定。發(fā)現(xiàn)使用70%甲醇的無(wú)尾果樣品提取率最高，故以70%甲醇為提取溶劑。

3.5 提取時(shí)間的考察

取同一批樣品4 份，各約0.25 g，放入4 個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)，用胖肚吸管取70%的甲醇50 mL，加入到錐形瓶一同稱重，分別加熱回流20 min、30 min、60 min、90 min，取出放冷后再次稱重，滴加70%甲醇，補(bǔ)重后震蕩，混勻后過(guò)濾，供試品溶液為續(xù)濾液，按以上色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明：30 min 后隨著回流時(shí)間增加，含量基本不變，故選擇提取時(shí)間為30 min。

3.6 方法評(píng)價(jià)

根據(jù)7 批樣品含量測(cè)定結(jié)果的差異性可得，建立的無(wú)尾果中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量測(cè)定方法，具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定性及重復(fù)性良好的優(yōu)點(diǎn)，能較好地控制其內(nèi)在質(zhì)量，為無(wú)尾果的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。