有氧運動對大鼠海馬和大腦皮質(zhì)P2X7受體表達(dá)的影響

沈鈺琳 王雪冰，2 馮連世 路瑛麗

1 國家體育總局體育科學(xué)研究所（北京100061）

2 廣西大學(xué)體育學(xué)院（南寧530004）

嘌呤能信號傳遞開始于細(xì)胞向胞外分泌以三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）為主的核苷酸。嘌呤受體按照作用物不同分為腺苷作用的Pl受體和ATP及其類似物作用的P2受體[1]。核苷酸P2X受體屬于配體門控的離子通道，具有傳遞細(xì)胞外ATP 的離子轉(zhuǎn)換作用，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)P2X 受體的7 個亞型（P2X1-7），廣泛分布于呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、骨骼肌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)[2-3]。其中的一個亞型嘌呤2X7受體（Purinergic 2X7 receptor，P2X7）被高濃度的細(xì)胞外ATP激活，使Ca2+和Na+進(jìn)入，K+通過漿膜向外流動，經(jīng)過多次刺激后，形成更大的膜孔，影響細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，P2X7受體在大腦海馬、皮質(zhì)等多個區(qū)域以及脊髓等組織都有表達(dá)，參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理功能，與神經(jīng)病理痛、抑郁癥、癲癇、阿爾茨海默癥等疾病的發(fā)病相關(guān)[5-7]。此外，P2X7可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活，促進(jìn)炎癥因子白細(xì)胞介素1β（interleu?kin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF -α）的產(chǎn)生，加重神經(jīng)退行性疾病中的細(xì)胞損傷[8]。有研究表明P2X7可能激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和絲裂酶原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，并與炎癥性疾病密切相關(guān)[9]。

研究顯示，有氧運動對改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，延緩帕金森、阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病有著積極的作用[10-11]，但目前關(guān)于有氧運動對中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)控機制尚不十分明確。因此，本研究通過4 周有氧訓(xùn)練，觀察大鼠海馬和大腦皮質(zhì)P2X7受體及其相關(guān)信號通路表達(dá)的變化，為有氧運動保護大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

14 周齡雄性SD 大鼠20 只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體重460～520 g。大鼠在自然光照、環(huán)境溫度21°C ～23°C、濕度40%～60%的動物房內(nèi)飼養(yǎng)，自由進(jìn)水進(jìn)食。2 周的適應(yīng)性喂養(yǎng)和訓(xùn)練（速度從16 m/min 逐步遞增到30 m/min，運動時間從20 min/d遞增到60 min/d）后，隨機分為安靜組（C組）和訓(xùn)練組（T 組），每組10 只。訓(xùn)練組大鼠于水平跑臺進(jìn)行有氧耐力訓(xùn)練，采用中等強度跑臺訓(xùn)練，相當(dāng)于50%VO2max 運動負(fù)荷強度，跑臺訓(xùn)練速度為30 m/min，每天運動1小時，每周5天，共4周[12]。

1.2 取材

訓(xùn)練第4周末，各組大鼠禁食禁水12 h，給予10%水合氯醛溶液（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，每組取6只大鼠腹主動脈取血，斷頭。迅速放在冰袋上取雙側(cè)海馬和部分大腦皮質(zhì)，PBS漂洗后置于凍存管，放入液氮罐內(nèi)冷凍，隨后將樣品轉(zhuǎn)入－80℃冰箱中保存，用于RT-qPCR、Western Blot 和ELISA 檢測。每組剩余4 只大鼠，麻醉后斷頭，完整取下整個大腦，置于4% PFA中固定，放入4℃冰箱保存，用于免疫熒光檢測。

1.3 主要試劑與儀器

兔抗P2X7 多克隆抗體（Alomone Labs），兔抗NFκB p65多克隆抗體（Affinity），山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG（Jackson），小鼠抗GFAP 多克隆抗體（Bioleg?end），小鼠抗β-actin 單克隆抗體，兔抗P38 多克隆抗體、兔抗p-P38 多克隆抗體、兔抗JNK 多克隆抗體、兔抗p-JNK多克隆抗體（CST），辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋），Trizol 試劑（Invitrogen），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix Taq?（Ex Taq? Version 2.0）試劑盒（TaKaRa），TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒（eBioscience），Roche Light?Cycler?480II 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)（Roche，CH），倒置顯微鏡（Olympus），成像系統(tǒng)（Q-Imaging）。

1.4 RT-qPCR檢測

應(yīng)用RT-qPCR 檢測各組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)P2X7 mRNA 表達(dá)。將－80℃冰箱中的海馬和大腦皮質(zhì)組織取出，分別置于勻漿器（預(yù)先用DEPC 處理）中，放在冰盒內(nèi)研磨。加入Trizol 混合提取RNA，再加入100 μl無核酶水，溶解RNA。用分光光度計讀取OD260/OD280比值及RNA 濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書條件將提取的RNA 取1 μg 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照Pre?mix Taq?（Ex Taq?Version 2.0）說明書要求，配制10 μl 的反應(yīng)體系。引物序列如下：P2X7 上游引物5’-GATGGATGGACCCACAAAGT-3’，下游引物5’-GCTTCTTTCCCTTCCTCAGC-3’；β-actin 上游引物5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’，下游引物5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’。使用Roche LightCycler?480II 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)進(jìn)行擴增并對結(jié)果進(jìn)行分析。設(shè)置PCR 反應(yīng)條件：95°C 5 min預(yù)變性后，95°C 10 s，60°C 30 s，72°C 30 s，40 個循環(huán)。結(jié)果使用2－△△CT法表示目的基因相對表達(dá)量。

1.5 Western Blot檢測

應(yīng)用Western Blot 檢測大鼠海馬、大腦皮質(zhì)P2X7、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65（nuclear factor kappa-B p65 p65）、p38 絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activat?ed protein Kinase，p38）、磷酸化p38（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinas，p-p38）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化JNK（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）蛋白的表達(dá)。取大鼠海馬和大腦皮質(zhì)置于組織勻漿器中，預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑，研磨混勻；置于低溫離心機（4℃）中12000 rpm 離心15 min，取上清，加入6×loading buffer，放入120°C水浴鍋中加熱5 min使蛋白變性。SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，根據(jù)抗體條帶位置剪下合適寬度的膜，分別浸在一抗兔抗P2X7 IgG（1 ∶300）、兔抗NF-κB p65 IgG（1:500）、兔抗P38 IgG（1∶1000）、兔抗p-P38 IgG（1∶1000）、兔抗JNK IgG（1∶1000）、兔抗p-JNK IgG（1∶1000），以及小鼠抗β-actin IgG（1∶1000）中，4℃孵育過夜。TBST漂洗3次，每次10 min，將膜轉(zhuǎn)至山羊抗兔IgG-HRP（1 ∶10000）、山羊抗 小 鼠IgG-HRP（1 ∶10000）二抗中室溫震蕩孵育1 h，TBST 清洗3 次，每次10 min。ECL 滴加到膜的蛋白面，反應(yīng)3～5 min；膠片曝光10 s～5 min（曝光時間隨不同光強度調(diào)整），顯影2 min，定影。通過Image-Pro Plus 圖像分析軟件讀取目的條帶的光密度掃描值，以各組條帶β-actin 的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組待測因子的蛋白表達(dá)量。

1.6 免疫熒光染色

應(yīng)用免疫熒光染色法觀察大鼠海馬、大腦皮質(zhì)P2X7陽性細(xì)胞的表達(dá)。將已在4%PFA中固定48 h后的大鼠大腦組織取出，4 °C脫水（浸入30%的蔗糖24 h進(jìn)行脫水處理，每8 h更換一次蔗糖水）。用恒冷切片機將組織切成10～12 μm厚的薄片，放入烤箱37°C烤片2 h，－20 °C 保存。取出切片平衡室溫30 min，用PBS 緩沖液清洗3 次，每次5 min。滴加10%山羊血清于37°C水浴鍋內(nèi)封閉1 h。用濾紙擦干封閉液，PBS清洗3 次，每次5 min，擦干，按比例配制一抗（P2X7 稀釋比例1∶100），混勻，滴加在玻片上覆蓋組織，放入4°C冰箱過夜。次日室溫放置30 min后，用PBS清洗3次，每次5 min 洗去一抗后加入帶有熒光標(biāo)記的二抗（山羊抗兔TRITC：1∶200），放入37°C 水浴鍋中避光孵育1 h。置于PBS緩沖液避光洗滌3次，每次5 min，用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，分析結(jié)果。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）

采用ELISA 實驗檢測各組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)TNF -α、IL-1β和IL-6 的表達(dá)水平。取各組大鼠部分海馬和大腦皮質(zhì)加入PBS 于冰上研磨，4℃條件下12000 r/min 離心15 min，取上清。從冰箱內(nèi)取出試劑盒，置于室溫下平衡30 min。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體、ABC 工作液按試劑盒說明書的要求配置。核算樣本所需的已包被抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目，參照試劑盒說明書完成后續(xù)各步驟操作。用酶標(biāo)儀在450 nm 測定吸光值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本吸光值，計算樣本中TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，顯著性檢驗選擇獨立樣本t檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 有氧運動對大鼠海馬和大腦皮質(zhì)P2X7表達(dá)的影響

實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過4 周有氧運動，T 組大鼠海馬（0.25 ± 0.05）和大腦皮質(zhì)（0.42 ± 0.07）P2X7 mRNA的表達(dá)水平較C 組（1.00 ± 0.00）顯著下降（P＜0.01）（圖1A）；在P2X7 蛋白表達(dá)水平方面，T 組大鼠海馬（0.45 ± 0.09）和大腦皮質(zhì)（0.38 ± 0.11）較C 組海馬（0.98 ± 0.09）和大腦皮質(zhì)（0.79 ± 0.13）均顯著下降（P＜0.01）（圖1B、C）。

圖1 各組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)P2X7 mRNA和蛋白的表達(dá)

2.2 各組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)P2X7免疫熒光染色結(jié)果

圖2 結(jié)果顯示，T 組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)P2X7 免疫熒光染色陽性細(xì)胞數(shù)量顯著少于C 組（P＜0.01），其中，T 組大鼠海馬P2X7 陽性細(xì)胞比例為6.58% ±2.14%，C組25.20% ± 3.82%；大腦皮質(zhì)中P2X7陽性細(xì)胞的表達(dá)比例為T 組55.22% ± 4.38%，C 組80.50% ±7.87%。

圖2 各組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)P2X7免疫熒光染色

2.3 有氧運動對大鼠海馬和大腦皮質(zhì)p65、P38、JNK信號通路表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，4 周有氧訓(xùn)練后，各組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)中P38、JNK 蛋白的表達(dá)無顯著差異（P＞0.05），在海馬組織中，C 組大鼠P38 和JNK 蛋白表達(dá)量分別為0.89 ± 0.10、0.52 ± 0.09，T 組分別為0.95 ± 0.13、0.53 ± 0.10；在大腦皮質(zhì)中，C 組大鼠P38 和JNK 蛋白表達(dá)量分別為0.91 ± 0.19、0.85 ± 0.17，T 組分別為0.94 ± 0.17、0.83 ± 0.14（圖3B、C）。

與C 組相比，T 組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)p65、p-P38以及p-JNK蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.01），其中，C 組大鼠海馬p65、p-P38 和p-JNK 蛋白表達(dá)量分別為1.05 ± 0.18、0.61 ± 0.14、1.06 ± 0.15，T 組分別為0.53 ± 0.10、0.32 ± 0.09、0.69 ± 0.10；C 組大鼠大腦皮質(zhì)p65、p-P38 和p-JNK 蛋白表達(dá)量分別為0.99 ±0.12、1.01 ± 0.18、1.06 ± 0.17，T 組分別為0.54 ±0.11、0.42 ± 0.10、0.61 ± 0.12（圖3D、E、F）。

圖3 各組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)p65、P38、p-P38、JNK、p-JNK蛋白的表達(dá)

2.4 有氧運動對大鼠海馬和大腦皮質(zhì)炎癥因子表達(dá)的影響

圖4 結(jié)果顯示，T 組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)TNF-α、IL-1β和IL-6 較C 組均顯著下降（P＜0.01）。其中，T 組大鼠海馬TNF-α、IL-1β和IL-6 的表達(dá)量分別為10.98± 0.99、4.26 ± 0.14、14.22 ± 2.00，C 組分別為13.49± 0.88、5.27 ± 0.31、22.65 ± 2.74；T 組大鼠大腦皮質(zhì)TNF-α、IL-1β和IL-6 的表達(dá)量分別為50.00 ± 2.63、3.87 ± 0.37、14.52 ± 3.73，C 組分別為63.20 ± 6.63、5.99 ± 0.94、30.78 ± 2.28。

圖4 各組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)

3 討論

P2X7受體在神經(jīng)系統(tǒng)的幾種細(xì)胞類型，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、施萬細(xì)胞和一些神經(jīng)元中都有表達(dá)[13-14]。其與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)聯(lián)，如多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默病、亨廷頓病和癲癇等。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，P2X7受體被激活后會導(dǎo)致主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和ATP的釋放[15]。在成年人大腦中，P2X7受體參與神經(jīng)元細(xì)胞在發(fā)育和死亡過程中向膠質(zhì)細(xì)胞表型的分化[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷與P2X7受體激活時間延長有關(guān)，可導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性毒性[18]。有氧運動對多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茲海默癥、帕金森病的恢復(fù)以及延緩大腦衰老都具有積極作用，長期有氧運動能夠增強海馬神經(jīng)元活性，減少脊髓前角神經(jīng)元的丟失，對神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用[19-20]。此外，有氧運動還可通過抑制P2X7 受體改善高脂飲食大鼠心肌炎癥、纖維化和細(xì)胞凋亡，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，延緩大鼠糖尿病腎病的病程進(jìn)展[21-22]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過4 周跑臺訓(xùn)練后，T 組大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬、大腦皮質(zhì)組織中的P2X7受體mRNA和蛋白表達(dá)水平較C 組大鼠均顯著下降，且免疫熒光實驗結(jié)果顯示，P2X7抗體染色后T組海馬和大腦皮質(zhì)P2X7陽性細(xì)胞顯著少于C 組，說明有氧運動能夠降低大鼠海馬和大腦皮質(zhì)中P2X7 受體的表達(dá)，提示P2X7 受體可能是有氧運動保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的一個靶點。

P2X7 受體調(diào)控非選擇性Ca2+通道，從而介導(dǎo)K+、Na+及Ca2+的通透性變化。它可以介導(dǎo)Na+和Ca2+內(nèi)流以及K+外流，并激活NF-κB和MAPK等多條信號通路，誘導(dǎo)IL-1β、IL-6 和TNF-α的生成[23-24]。NF-κB 在哺乳動物細(xì)胞中是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以綁定各種細(xì)胞基因啟動子和增強子序列，通過控制許多重要的細(xì)胞因子、粘附分子和趨化因子，在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞生長調(diào)控中起著重要作用，參與細(xì)胞增殖和凋亡過程[25-27]。NF-κB p65是NF-κB 通路中一個重要的轉(zhuǎn)錄子，可與基因啟動子或增強子特異性結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄，NF-κB p65 蛋白由胞漿向核轉(zhuǎn)移是NF-κB 信號通路激活的關(guān)鍵點[28]。NF-κB 的激活需要P2X7 受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，嘌呤能信號通過P2X7受體選擇性靶向激活NF-κB[29]。細(xì)胞外ATP 可通過P2X7R-NFκB（p65）途徑促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放，已有研究表明，P2X7 激動劑可激活NF-κB p65 信號通路，而使用P2X7抑制劑則會抑制p65的表達(dá)，說明P2X7受體參與NF-κB信號通路的調(diào)控[30-31]。研究顯示，適當(dāng)強度的有氧耐力訓(xùn)練可以避免中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞受到各種應(yīng)激損傷，可通過抑制NF-κB 的活化發(fā)揮對阿爾茲海默病大鼠大腦的保護作用[32-33]。MAPK 信號通路調(diào)節(jié)包括p38、ERK 和JNK 在內(nèi)的基因的表達(dá)，這些基因與免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)，p38的激活會導(dǎo)致caspase-3的產(chǎn)生，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[34]。有研究證實，抑制P2X7 和MAPKs在帕金森和腦出血模型中提供了顯著的神經(jīng)保護作用[35-36]。P2X7可以介導(dǎo)p38MAPK 的磷酸化，激活JNK信號通路，P2X7拮抗劑能夠通過阻斷p38MAPK的磷酸化抑制細(xì)胞凋亡，從而起到神經(jīng)保護功能[37-38]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4周跑臺有氧訓(xùn)練后，大鼠海馬、大腦皮質(zhì)組織p65 蛋白表達(dá)水平較對照組均顯著下降；各組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)中P38、JNK 無顯著差異，改變體現(xiàn)在其磷酸化水平，T組大鼠p-P38和p-JNK的表達(dá)較C組相比顯著下降。這表明有氧運動在抑制P2X7受體表達(dá)的同時，能夠降低大鼠海馬、大腦皮質(zhì)p65 的表達(dá)，抑制P38和JNK蛋白的磷酸化，從而抑制NF-κB以及MAPK 信號通路。此外，P2X7 受體參與調(diào)節(jié)炎性因子的分泌，NF-κB 的激活也常伴有炎癥細(xì)胞聚集以及未成熟炎癥細(xì)胞因子IL-1、IL-6 和TNF-α 的合成，抑制或敲除P2X7受體可有效阻斷IL-1β等炎癥因子的產(chǎn)生[4]。本研究也發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，訓(xùn)練組大鼠海馬和大腦皮質(zhì)中炎癥因子TNF-α、IL-1β以及IL-6 的表達(dá)水平均顯著下降，說明有氧運動可能通過抑制大鼠海馬和大腦皮質(zhì)P2X7受體的產(chǎn)生，減少炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用。

4 結(jié)論

有氧運動通過降低大鼠海馬和大腦皮質(zhì)P2X7 受體的表達(dá)，抑制了p65、P38、JNK信號通路，減少了炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，這可能是其保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的機制之一。