QuEChERs-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)甘蔗中15種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的方法研究

李長(zhǎng)成，黃敏興*，陳其釗，王桂華，李家威，高裕鋒

(1廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所，廣東廣州510316；2國(guó)家糖業(yè)質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東廣州510316)

0 引言

甘蔗是最主要的糖料作物，是重要戰(zhàn)略物資食糖的主要原料。同時(shí)我國(guó)是世界主要的食糖生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)。截至 2020/21年榨季，我國(guó)產(chǎn)糖量排名世界第4[1]。因此發(fā)展甘蔗種植產(chǎn)業(yè)，提升甘蔗品質(zhì)，對(duì)保障國(guó)民經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定、改善民生具有深遠(yuǎn)戰(zhàn)略意義。目前我國(guó)甘蔗種植主要分布在廣西、廣東、云南、海南等熱帶和亞熱帶氣候區(qū)域。由于熱帶和亞熱帶區(qū)域高溫濕熱的氣候特點(diǎn)，害蟲(chóng)活躍度高、繁殖性強(qiáng)，極易引起甘蔗病蟲(chóng)害，嚴(yán)重影響甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)可造成 8%～20%不等的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失[2]，嚴(yán)重制約著我國(guó)甘蔗產(chǎn)業(yè)的種植規(guī)模、生產(chǎn)效益和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力發(fā)展。因此，做好預(yù)防甘蔗病蟲(chóng)害防治尤為重要，而使用農(nóng)藥的化學(xué)防治是目前防治甘蔗病蟲(chóng)害的重要技術(shù)手段。

有機(jī)磷農(nóng)藥是用于防治植物病蟲(chóng)害的化合物。我國(guó)生產(chǎn)和使用的有機(jī)磷農(nóng)藥大多數(shù)屬于中高毒性，具有殺蟲(chóng)范圍廣、殺蟲(chóng)效率高、價(jià)格低廉、用藥量少等特點(diǎn)，在各品類農(nóng)藥的生產(chǎn)量、數(shù)量和市場(chǎng)占有率等方面均居首位，目前在防治農(nóng)林業(yè)的病蟲(chóng)害方面具有實(shí)際意義[3]。該類化合物的使用能大大改善甘蔗蟲(chóng)害的情況，保護(hù)作物的正常生長(zhǎng)和提高產(chǎn)量。然而，目前存在盲目增加施藥量、忽視休藥期等使用不當(dāng)情況，易造成環(huán)境污染和食品安全問(wèn)題[4-8]。因此，建立高效、快速、準(zhǔn)確的甘蔗中有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法，對(duì)準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)甘蔗中有機(jī)磷殘留量具有重要意義。

有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)方法主要有酶抑制法、氣相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳微滲透法等[9]。此前，國(guó)內(nèi)外鮮少有針對(duì)甘蔗中有機(jī)磷農(nóng)藥的多農(nóng)藥殘留方法研究，本文擬結(jié)合甘蔗中有機(jī)磷農(nóng)藥的使用情況和特點(diǎn)，針對(duì)甘蔗的蔗糖含量高、其他有機(jī)質(zhì)復(fù)雜等特點(diǎn)，以QuEChERS法作為前處理方法，并進(jìn)行方法優(yōu)化[10-12]，建立一套高效、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定甘蔗中有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留的液相色譜質(zhì)譜檢測(cè)方法，以期為甘蔗中有機(jī)磷多農(nóng)藥殘留監(jiān)測(cè)和防控提供有效技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試劑

供試甘蔗樣品從市場(chǎng)中隨機(jī)選取，乙腈(色譜純，賽默飛世爾科技公司)，無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉(分析純，廣州化學(xué)試劑有限公司)，PSA、C18、石墨化炭黑(GCB)(分析純，廣州譜登生物科技公司)，有機(jī)相濾膜(0.22 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司)。

15種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液(保棉磷、地蟲(chóng)硫磷、甲拌磷、甲基硫環(huán)磷、甲基異柳磷、硫線磷、馬拉硫磷、氧化樂(lè)果、樂(lè)果、水胺硫磷、辛硫磷、二嗪磷、特丁硫磷、久效磷、甲基對(duì)硫磷，100 mg/L，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所)。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-質(zhì)譜儀(QTrap 5500，美國(guó)AB SCIEX公司)；Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司)；高速勻漿機(jī)(北京中科科爾儀器有限公司)；Vortex-Genie 2渦旋混勻器(奧然科技有限公司)；電子天平(0.1 mg，日本AND公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確移取以上 15種有機(jī)磷的標(biāo)準(zhǔn)品各 1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，搖勻，配制濃度均為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取配制好的10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL，用乙腈定容至10 mL，配制濃度為1 mg/L的15種有機(jī)磷的標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)儲(chǔ)備液。取上述的標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)儲(chǔ)備液，用乙腈溶液逐級(jí)稀釋，配制濃度為2、5、10、20、50、100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取甘蔗樣品5 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞聚丙烯離心管中，加入15 mL乙腈，渦旋5 min，經(jīng)4500 r/min離心機(jī)離心5 min后過(guò)濾，濾液加入5 g NaCl，渦旋5 min后靜置分層，超聲15 min，離心(8000 r/min，5 min)，待凈化。

移取5 mL上清液至含有填充材料的凈化管內(nèi)(50 mg PSA和100 mg C18)，搖勻，靜置后準(zhǔn)確移取1 mL至玻璃刻度試管，氮吹至近干，用1 mL 30%的乙腈水溶液復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后供上機(jī)分析。

1.3.3 LC-MS條件

色譜條件：Phenomenex Luma Omega C18色譜柱(2.6 μm 100×2.1 mm)，柱溫箱溫度：40℃，進(jìn)樣量：5 μL，流動(dòng)相A：5 mmol/L乙酸銨+1%甲酸水，流動(dòng)相B：乙腈，流速：0.4 mL/min，梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序表

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI+)，有機(jī)磷農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

通過(guò)比較純水、5 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相A，以及甲醇、乙腈作為流動(dòng)相B的流動(dòng)相體系效果。結(jié)果表明，在流動(dòng)相 A中添加乙酸銨后，有助于改善部分目標(biāo)化合物的峰形；流動(dòng)相體系 B中，乙腈作為洗脫溶劑，15種有機(jī)磷均有較好保留，峰形和響應(yīng)均較好。因此，流動(dòng)相體系選擇5 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相 A，乙腈作為流動(dòng)相 B，采用優(yōu)化后的色譜條件，15種有機(jī)磷的靈敏度較高，峰形尖銳對(duì)稱，見(jiàn)圖1。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)15種有機(jī)磷的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在正離子模式(ESI+)下進(jìn)行全掃描，確定分子離子，把分子離子作為母離子，給予一定的碰撞能量和碰撞氣體，全掃描二級(jí)離子，選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的2個(gè)子離子，與母離子分別組成定性及定量離子對(duì)，并優(yōu)化去簇電壓和碰撞電壓，15種有機(jī)磷的質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 15種有機(jī)磷農(nóng)藥LC-MS/MS分析條件

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)[13]是指樣品中被分析物以外的共流出組分對(duì)分析物的響應(yīng)值有干擾，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過(guò)測(cè)定含基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液和不含基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出圖2的斜率比值。

圖2 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與不含基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值

在 2～100 μg/L線性范圍內(nèi)，含基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與不含基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的比值在 0.68～1.24之間。以斜率比值在 1.0作為基準(zhǔn)來(lái)衡量，地蟲(chóng)硫磷、特丁硫磷、硫線磷可認(rèn)為凈化后無(wú)明顯的基質(zhì)效應(yīng)，馬拉硫磷、甲基對(duì)硫磷、保棉磷均出現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，而氧化樂(lè)果、水胺硫磷出現(xiàn)了較強(qiáng)的基質(zhì)抑制作用。由于基質(zhì)效應(yīng)在檢測(cè)工作中普遍存在，在對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行分析時(shí)，需采用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

在液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)體系中，內(nèi)源性雜質(zhì)會(huì)對(duì)目標(biāo)物產(chǎn)生離子抑制效應(yīng)，不但會(huì)降低儀器對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)靈敏度，還會(huì)影響樣品加標(biāo)回收率。而甘蔗富含維生素、膳食纖維、糖分等，因此，有必要對(duì)甘蔗的乙腈提取溶液進(jìn)行凈化處理。

試驗(yàn)中對(duì)PSA、C18和GCB 3種填料的使用量(0、50、100、150、200 mg 5個(gè)使用量)進(jìn)行了試驗(yàn)，通過(guò)比較PSA、PSA+GCB、PSA+C18、PSA+GCB+C18作為凈化填料的回收率，確定凈化填料種類和用量選擇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)混合填料中存在GCB時(shí)i，特丁硫磷的回收明顯下降至70%以下，這主要是特丁硫磷是平面分子結(jié)構(gòu)，可被GCB吸附；而當(dāng)混合填料中PSA和C18的使用量分別為50和100 mg時(shí)，樣品回收率較高，在 83.00%～109.22%之間，詳見(jiàn)表3，符合檢驗(yàn)要求。

表3 15種有機(jī)磷農(nóng)藥在最優(yōu)凈化條件下的回收率數(shù)據(jù)

2.5 方法線性和檢出限

15種有機(jī)磷的線性范圍和回歸方程見(jiàn)表4，15種有機(jī)磷線性良好，相關(guān)系數(shù)(r2)在0.9991～0.9999之間。按 3倍信噪比(S/N)和 10倍信噪比確定本方法 15種有機(jī)磷的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，如表4所示，檢出限在0.01～0.38 μg/kg之間，定量限在0.03～1.27 μg/kg之間，滿足甘蔗中有機(jī)磷的檢驗(yàn)需求。

表4 15種有機(jī)磷的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限、定量限

2.6 回收率與精密度

在同一空白甘蔗樣品中分別準(zhǔn)確添加0.05、0.1、0.2 mg/kg 3個(gè)水平的15種有機(jī)磷農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平做6次平行實(shí)驗(yàn)，按照所建立的方法進(jìn)行樣品提取、凈化及檢測(cè)，計(jì)算平均回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，甘蔗樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥加標(biāo)回收率在 81.89%～104.95%，精密度為0.84%～4.98%，滿足GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》[14]要求。

表5 方法回收率及精密度 單位：%

2.7 樣品分析

按照上述建立的方法檢測(cè)了從市場(chǎng)上購(gòu)買回來(lái)的20批次甘蔗，除1批次檢出樂(lè)果，檢出值為4.52 μg/kg外，其余樣品均未檢出上述15種有機(jī)磷農(nóng)藥。符合GB 2763-2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[15]規(guī)定。

3 結(jié)論

本研究建立了甘蔗中 15種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)的檢測(cè)方法，樣品用乙腈提取，在采用 QuEChERS技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì) PSA、C18、炭黑的配比進(jìn)行了優(yōu)化，該方法高效靈敏，簡(jiǎn)便快捷，回收率在 81.89%～104.95%之間，精密度在0.84%～4.98%之間，滿足日常檢測(cè)的要求。