蘄艾艾粉提取物對多種植物病原真菌的抑制作用

李金鑫，陳巧環(huán)，王蘊(yùn)涵，周佳，劉大會，苗玉煥

湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065

植物源農(nóng)藥取材于植物中的天然活性成分，在自然環(huán)境中可被有效降解，利用植物源農(nóng)藥對農(nóng)作物病蟲害進(jìn)行防治，對環(huán)境保護(hù)、生態(tài)平衡具有重要意義，因此近年來被大力提倡和推廣。植物源殺菌劑為植物源農(nóng)藥中的一個重要組成部分，是利用植物中的抗菌物質(zhì)或誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物防衛(wèi)素而開發(fā)出來的新型農(nóng)藥，可以有效殺死或有效抑制病原菌的生長[1]。植物源殺菌劑因其種類繁多，資源豐富，并且無殘留，低毒或無毒，不易使病原菌產(chǎn)生抗性，且易于與其他農(nóng)藥混配而日益成為研究的熱點(diǎn)[2]。

我國藥用植物資源豐富，中藥植物中的多種次生代謝產(chǎn)物具有良好的抗菌活性，為植物源殺菌劑的開發(fā)提供了龐大的資源庫。據(jù)統(tǒng)計，我國作為殺菌劑的植物主要集中于楝科、菊科、豆科等30多科[3]。菊科植物艾(ArtemisiaargyiLevl et Van)的干燥葉片，為我國常用中藥材，其不僅具有止血、抗腫瘤、保肝、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、止咳平喘等多種藥理作用[4]，此外還被廣泛報道具有較強(qiáng)的抑菌活性[5]。

蘄艾為我國著名道地藥材，生產(chǎn)艾絨用于艾灸是其主要使用途徑。一般情況下，每生產(chǎn)1 kg艾絨需要5～30 kg艾葉，剩余的廢棄物包括葉肉組織、葉柄、葉脈和其他細(xì)小碎片，俗稱艾粉。艾粉富含艾葉中的大量活性物質(zhì)，包括黃酮類、苯丙素類、萜類等成分[4],卻未被充分利用。據(jù)初步統(tǒng)計，我國每年產(chǎn)生艾粉超1萬t，因艾粉密度小、體積大，且尚未在市場上得到應(yīng)用；造成其儲存占用大量的廠房空間、處理成本升高，成為制約艾葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素之一。因此，亟需一種有效利用艾粉的方法，解決艾產(chǎn)業(yè)鏈中的廢棄物處理問題。本研究以蘄艾艾粉為研究對象，探究其提取物對稻瘟病菌、山茶炭疽病菌、煙草蛙眼病菌、齊整小核菌、絲核菌、禾谷鐮刀菌、鏈格孢、層出鐮刀菌、茄病鐮刀菌共9種植物病原真菌的抑制作用，旨在為植物源殺菌劑的開發(fā)、艾葉資源的充分利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1)供試菌種。稻瘟病菌(Magnaporthgrisea)、山茶炭疽病菌(Gloeosporiumtheae-sinensis)、煙草蛙眼病菌(Cercosporanicotianae)、齊整小核菌(Sclerotiumrolfsii)由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理重點(diǎn)實驗室提供；絲核菌(Rhizoctoniasolani)、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所提供；鏈格孢(Alternariaalternata)、層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)、茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)由湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源中心實驗室提供。

2)材料和試劑。艾粉(干)來自湖北省黃岡市蘄春縣的湖北惠春蘄艾健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)，新綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(DSTDX001501，純度≥98%)、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(DST200822-021，純度≥98%)、隱綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(DSTDY003501，純度≥98%)均購于德斯特生物科技有限公司，異綠原酸B標(biāo)準(zhǔn)品(RFS-Y06911812012，純度≥98%)、異綠原酸A標(biāo)準(zhǔn)品(RFS-Y06801911011，純度≥98%)、異綠原酸C標(biāo)準(zhǔn)品(RFS-Y07011805016，純度≥98%)均購于成都瑞芬思生物科技有限公司，山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品(B21126- 20，純度≥98%)購于上海源葉生物科技有限公司，棕矢車菊素標(biāo)準(zhǔn)品(PS001167，純度均≥98%)購于成都普思生物科技股份有限公司，異澤蘭黃素標(biāo)準(zhǔn)品(025-83428615，純度≥98%)購于杭州草本源生物技術(shù)有限公司，乙酸乙酯、無水乙醇、石油醚、苯酚、乳酸、甘油、棉蘭等試劑均為分析純。

1.2 蘄艾艾粉5種提取物的制備及其指紋圖譜

稱取干燥蘄艾艾粉125 g共5份，分別用500 mL水、石油醚、50%乙醇(體積分?jǐn)?shù))、無水乙醇、乙酸乙酯進(jìn)行提取，藥液比(m/V)為1∶4。提取方法為：在提取容器中充分將藥液攪拌均勻，隨后將提取容器置于超聲儀中超聲30 min，冷浸提取24 h，使用雙層濾藥袋過濾，濾液保存?zhèn)溆?；濾渣再次加入相應(yīng)溶劑500 mL超聲30 min后冷浸提取24 h并過濾。合并二次濾液，抽濾后置于恒溫水浴鍋中揮發(fā)至濾液呈濃稠狀，于真空干燥箱中真空干燥(30 ℃、20 Pa)，得到5種艾粉不同溶劑提取物，低溫保存?zhèn)溆?。按照以下公式計算提取率?/p>

提取率=(可溶性浸出物的干質(zhì)量/艾粉質(zhì)量)×100%

參照盧化等[6]的方法構(gòu)建蘄艾艾粉不同溶劑提取物的指紋圖譜。色譜條件:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱,流動相為乙腈(A) - 0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～12 min,10%～20% A; 12～25 min,20%～25% A; 25～50 min,25%～65% A; 50～55 min,65%～10% A),流速0.8 mL/min,檢測波長330 nm,柱溫 30 ℃。稱量上述各溶劑提取物0.02 g，溶于1.5 mL 80%甲醇后過0.45 μm濾膜得到供試品溶液。采用艾葉中常見的有效成分新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、山奈酚、棕矢車菊素、異澤蘭黃素標(biāo)準(zhǔn)品作為對照。

1.3 蘄艾艾粉提取物的抑菌活性測定

抑菌活性采用菌絲生長速率法[7]進(jìn)行測定。準(zhǔn)確稱量各提取物2.0 g，用5 mL乙醇溶解后加到95 mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，高壓蒸汽滅菌鍋滅菌(121 ℃，15 min)后制成各提取物含藥培養(yǎng)基，以含5%乙醇的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基為空白對照組(CK)。選取部分病原真菌菌種，用打孔器在病菌純菌落邊緣打孔切取菌餅，分別接種于空白對照培養(yǎng)基和各提取物含藥培養(yǎng)基；根據(jù)真菌的生長速率，在CK組菌落接近長滿培養(yǎng)基時，采用十字交叉法對菌落直徑進(jìn)行測量并計算菌絲生長抑制率，比較不同提取物之間的抑菌效果，篩選艾粉抑菌活性的最強(qiáng)部位。各處理組均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

抑制率=[(空白對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/
(空白對照組菌落直徑-菌餅直徑)]×100%

1.4 蘄艾艾粉乙酸乙酯提取物對供試病原菌的毒力測定

準(zhǔn)確稱取艾粉乙酸乙酯提取物0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g，按照本文材料與方法“1.3”的方法配置成含藥量分別為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 g/L的培養(yǎng)基，并選取稻瘟病菌等9種病原菌為供試菌種，按照本文材料與方法“1.3”的方法測定菌絲生長抑制率，繪制濃度-抑制率曲線，計算艾粉乙酸乙酯提取物對各病原真菌的毒力方程和EC50值。各處理組3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 菌落形態(tài)和菌絲生長的觀察

觀察材料與方法“1.4”中空白組和高劑量處理組(12.5 g/L)的菌落形態(tài)發(fā)育情況，并拍照保存記錄。用無菌針挑取各菌落菌絲少量，置于載玻片上，棉蘭染液(苯酚20 mL、乳酸20 mL、甘油40 mL、棉蘭0.05 g、超純水20 mL)染色后制片。置于熒光倒置顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用 Excel 2010和SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)分析不同處理組的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘄艾艾粉不同溶劑可溶性浸出物的提取率及其指紋圖譜比較

5種不同溶劑提取艾粉中活性成分的結(jié)果見表1。從表1可以看出，極性溶劑(乙酸乙酯、乙醇、水)相對于非極性溶劑(石油醚)具有更高的提取率。極性溶劑中，乙酸乙酯和乙醇提取率相似，提取物性狀也較為接近；50%乙醇兼容水溶性成分和醇溶性成分，提取率最高，其次為水提物的提取率。說明極性溶劑更有利于艾粉粗提物的提取，且水溶性成分總量多于醇溶性成分。

表1 5種不同溶劑對蘄艾艾粉的提取率 Table 1 The extraction yields of A. argyi powder by five different solvents

蘄艾艾粉不同溶劑提取物指紋圖譜結(jié)果表明不同溶劑提取物之間的成分及其含量差異較大。水提物中的成分主要集中在極性較強(qiáng)部位，基本前15 min出峰，12.5 min時具有1個高含量成分峰。50%乙醇提取物包含水溶性成分和醇溶性成分，所含成分種類多于其他提取物，其中異綠原酸類成分含量高于無水乙醇提取物，但山奈酚、棕矢車菊素、異澤蘭黃素等黃酮類成分較無水乙醇提取物低。無水乙醇提取物和乙酸乙酯提取物指紋圖譜較為相似，主要成分集中在靠后時間段出峰，包括山奈酚、棕矢車菊素、異澤蘭黃素等成分，但無水乙醇提取物在20～25 min處，較乙酸乙酯提取物多3種異綠原酸類成分。石油醚提取物有效成分種類較少，在此指紋圖譜測定條件下，僅在44 min左右檢測到1個有效成分峰，為異澤蘭黃素，且含量較低(圖1)。

2.2 蘄艾艾粉提取物對幾種植物病原真菌的離體抑菌活性

為初步篩選蘄艾艾粉抑制真菌活性最強(qiáng)的極性部位，使用高質(zhì)量濃度(20 g/L)的各溶劑提取物進(jìn)行離體抑菌試驗，結(jié)果如表2所示。不同的提取溶劑對同一種病原真菌表現(xiàn)為不同程度的抑制或促進(jìn)作用，且具有顯著差異性。除去個別例外，如石油醚對稻瘟病菌具有較高的抑制率(達(dá)到81.17%)、對絲核菌具有一定的促進(jìn)作用等，整體而言，5種溶劑提取物的抑菌活性為：乙酸乙酯>無水乙醇>50%乙醇>石油醚>水。這5種提取物對同一病原菌具有不同的抑菌活性，且不同病原菌對艾粉提取物的抑菌活性具有不同的敏感性，綜合表2中數(shù)據(jù)可得，艾粉乙酸乙酯提取物相較于其他溶劑提取物，對植物病原真菌具有更強(qiáng)的抑制作用。

A：水提取物 Water extrac； B：50%醇提取物 50% ethanol extract； C：無水乙醇提取物 Pure ethanol extract； D：乙酸乙酯提取物 Ethyl acetate extract； E：石油醚提取物 Petroleum ether extract； F：標(biāo)準(zhǔn)品 Standard； 1：新綠原酸 Neochlorogenic acid；2：綠原酸 Chlorogenic acid； 3：隱綠原酸 Cryptochlorogenic acid； 4：異綠原酸 B Isochlorogenic acid B； 5：異綠原酸 A Isochlorogenic acid A； 6：異綠原酸C Isochlorogenic acid C； 7：山奈酚 Kaempferol； 8：棕矢車菊素 Jaceosidin； 9：異澤蘭黃素 Eupatilin.

表2 艾粉不同溶劑提取物對植物病原真菌的抑制作用 Table 2 Inhibitory effects of different solvent extracts of A. argyi powder on plant pathogens )

2.3 蘄艾艾粉乙酸乙酯提取物對植物病原真菌的毒力

蘄艾艾粉乙酸乙酯提取物對植物病原真菌的抑制作用存在明顯的量效關(guān)系，提取物濃度越高，抑制活性越強(qiáng)。較低質(zhì)量濃度(2.5 g/L)處理下，齊整小核菌對其最為敏感，抑制率達(dá)到63.76%；隨著處理質(zhì)量濃度的增高，稻瘟病菌、山茶炭疽病菌的受抑制程度顯著高于其他病原菌，12.5 g/L時抑制率分別達(dá)到91.67%、87.09%。低質(zhì)量濃度艾粉乙酸乙酯提取物處理下，鏈格孢、煙草蛙眼病菌受抑制程度較弱，隨著處理質(zhì)量濃度的升高，菌絲生長受抑制程度加強(qiáng)，處理質(zhì)量濃度為12.5 g/L時,抑制率分別達(dá)到78.59%、77.78%。通過濃度梯度法求取艾粉乙酸乙酯提取物對各供試病原菌的毒力回歸方程和EC50值，結(jié)果見表3。線性模擬方程表明艾粉對齊整小核菌的抑制效果最為明顯，毒力方程為Y=0.0234X+0.596，相關(guān)性系數(shù)0.974 4，EC50值為1.63 g/L；其次，對稻瘟病菌、山茶炭疽病菌、鏈格孢和煙草蛙眼病菌也具有較強(qiáng)的抑制作用，EC50值分別為2.88、3.38、5.73、5.77 g/L；對絲核菌、層出鐮刀菌、茄病鐮刀菌、禾谷鐮刀菌的抑制作用相對較弱。

表3 不同質(zhì)量濃度乙酸乙酯提取物對供試病原真菌的毒力回歸方程和EC50值 Table 3 Virulence equation and EC50 value of ethyl acetate extracts at different concentrations on pathogenic fungi

2.4 蘄艾艾粉乙酸乙酯提取物對植物病原真菌菌落形態(tài)的影響

蘄艾艾粉乙酸乙酯提取物對敏感性較強(qiáng)的菌種(如稻瘟病、山茶炭疽病菌)能夠直接抑制其菌絲的萌發(fā)生長，使之不產(chǎn)生菌落(圖2A、2B)；或者菌絲萌發(fā)但生長受到強(qiáng)烈抑制(如煙草蛙眼病菌、齊整小核菌)，菌落極小(圖2E、2I)。對于敏感性相對較弱的菌種，雖然菌絲仍然可以生長但其菌落形態(tài)發(fā)生明顯變化，如層出鐮刀菌的菌落由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色(圖2F)；此外，互隔交鏈孢霉菌落顏色也由深黑色變?yōu)辄S棕色(圖2C)，推測其可能的原因是提取物影響到真菌的生長發(fā)育過程、導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物出現(xiàn)較大差異。

A：稻瘟病菌 M. grisea； B：山茶炭疽病菌 G. theae-sinensis； C：鏈格孢A. alternata； D：絲核菌 R. solani； E：煙草蛙眼病菌 C. nicotianae； F：層出鐮刀菌 F. proliferatum； G：茄病鐮刀菌 F. solani； H：禾谷鐮刀菌 F. graminearum； I：齊整小核菌 S. rolfsii.

2.5 蘄艾艾粉乙酸乙酯提取物對幾種典型致病菌菌絲生長的影響

菌絲顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，相較于空白對照，不同病原菌提取物處理后其顯微結(jié)構(gòu)會發(fā)生不同的異常變化，變化主要包括4種類型，如層出鐮刀菌的分生孢子數(shù)量明顯減小(圖3A)，表明其繁殖過程受到抑制；絲核菌的菌絲體出現(xiàn)明顯皺縮，部分連接處發(fā)生斷裂(圖3B)，齊整小核菌的菌絲較空白對照更為細(xì)弱，且生長雜亂(圖3C)，表明其生長過程受到抑制；鏈格孢的膜透性發(fā)生改變，處理組菌絲體更易被棉蘭染液染成藍(lán)色(圖3D)，表明其正常的生命進(jìn)程受到影響。

A：層出鐮刀菌 F. proliferatum； B：絲核菌 R. solani； C：齊整小核菌 S. rolfsii； D：鏈格孢A. alternata.

3 討 論

明確可高效提取植物抑菌活性成分的溶劑，對鑒定主要抑菌物質(zhì)、深入開發(fā)植物源殺菌劑具有指導(dǎo)意義。如楊春等[8]通過石油醚、乙酸乙酯、丙酮和水對錦燈籠進(jìn)行浸提，發(fā)現(xiàn)錦燈籠乙酸乙酯提取物相較于其他提取溶劑具有更強(qiáng)的抑制效果；太行菊乙醇提取液抑菌效果好于水提液，其中80%乙醇提取液抑菌效果最顯著[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，艾粉不同溶劑提取物的抑菌效應(yīng)強(qiáng)弱為乙酸乙酯>無水乙醇>50%乙醇>石油醚>水，表明艾粉抑制植物病原真菌的活性成分主要為酯溶性成分和醇溶性成分。目前艾葉揮發(fā)油被廣泛報道具有良好的抑菌活性，但揮發(fā)油提取率通常較低，為0.75～1.75 mL/100 g[10]，艾粉乙酸乙酯提取物的提取率可達(dá)7.49%，具備大量開發(fā)為植物源殺菌劑的潛能。

本研究在確定乙酸乙酯為提取艾粉抗真菌活性成分的理想溶劑后，通過濃度梯度法測定了艾粉乙酸乙酯提取物對9種供試病原菌的抑制活性。結(jié)果顯示，艾粉乙酸乙酯提取物對9種植物病原菌的生長均具有抑制作用，其中齊整小核菌受抑制最為明顯，稻瘟病菌、山茶炭疽病菌、鏈格孢、煙草蛙眼病菌次之，絲核菌、層出鐮刀菌、茄病鐮刀菌、禾谷鐮刀菌受抑制程度相對較弱。此外，病原菌正常的菌落發(fā)育和菌絲生長在艾粉處理條件下均出現(xiàn)明顯異常。表明艾粉提取物對齊整小核菌導(dǎo)致的白絹病[11]、稻瘟病菌導(dǎo)致的稻瘟病、山茶炭疽病菌導(dǎo)致的山茶炭疽病、鏈格孢導(dǎo)致的葉斑病[12]、煙草蛙眼病菌導(dǎo)致的煙草蛙眼病可能具有良好的防治效果，對絲核菌導(dǎo)致的紋枯病和鐮刀菌屬真菌導(dǎo)致的根腐病也可能具有一定的抑制作用，是一種抑菌作用較強(qiáng)且具有廣譜抗真菌活性的天然殺菌劑。筆者所在課題組在田間種植菊花的試驗中，發(fā)現(xiàn)菊花根腐病的致病菌主要包括齊整小核菌、茄病鐮刀菌等多種致病菌[13]，而田間施撒艾粉0.1 kg/m2和0.2 kg/m2時根腐病發(fā)病率可分別下降42.77%和68.49%[13-14]。此外，艾粉乙酸乙酯提取物還能明顯抑制黃萎病菌對棉花的侵染，棉花傷根處理(浸泡于黃萎病菌孢子液中)后種植，土壤中拌入乙酸乙酯提取物后可有效降低棉花黃萎病的發(fā)病指數(shù)，當(dāng)施用量達(dá)到2.00 g/kg(提取物含量/土壤)時，可以完全阻斷黃萎病菌對棉花的侵染[15]。艾粉及其乙酸乙酯提取物在作為天然殺菌劑應(yīng)用的過程中，均表現(xiàn)出良好的活性，具備進(jìn)一步開發(fā)成商用植物源殺菌劑的潛力。艾粉中主要含有萜類、黃酮、苯丙素、芳香酸(醛)、甾體及脂肪酸等化學(xué)成分[16]，而雜環(huán)類植物源殺菌活性成分主要是生物堿類、黃酮類、香豆素類等化合物[17]，艾粉乙酸乙酯提取物中抑菌活性成分的鑒定還有待進(jìn)一步深入研究。