青蒿素耐藥與脾臟清除瘧原蟲機(jī)制研究進(jìn)展

王華晶，姜廷良，李滄海

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 1.青蒿素研究中心、2.中藥研究所唐氏中藥研究中心，北京 100700)

青蒿素的低毒性與強(qiáng)大的抗瘧活性，使其從上市以來(lái)一直是抗瘧治療的一線藥物。由于瘧原蟲(plasmodium)對(duì)氯喹(chloroquine)、奎寧(quinine)等單一化學(xué)抗瘧藥物的敏感性逐漸降低，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦了以青蒿素及其衍生物為基礎(chǔ)與其它抗瘧藥配伍使用的青蒿素聯(lián)合療法,簡(jiǎn)稱為ACT療法(artemisinin-based combination therap，ACTs)，一般用藥三日就可達(dá)到治療效果，該方法可顯著降低瘧疾的死亡率[1]。

近些年，東南亞一些國(guó)家尤其是柬埔寨相繼出現(xiàn)了經(jīng)ACTs三日治療以后，血液內(nèi)仍存有瘧原蟲的病例。也就是瘧原蟲的清除時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致世衛(wèi)組織在2005年的《全球耐藥性報(bào)告》中對(duì)可能存在的青蒿素耐藥性提出了擔(dān)憂[2]。2007年，在柬埔寨拜林地區(qū)進(jìn)行了一項(xiàng)研究，單用青蒿琥酯或采用青蒿琥酯與甲氟喹聯(lián)用治療瘧疾患者，發(fā)現(xiàn)這兩種治療方法都會(huì)引起瘧疾患者血液內(nèi)的瘧原蟲清除時(shí)間延長(zhǎng)。因此，提出了瘧原蟲對(duì)青蒿素類藥物產(chǎn)生了耐藥性。青蒿素耐藥性的最新定義是[3]：青蒿琥酯單藥治療或ACTs治療瘧疾患者后，血液中瘧原蟲清除時(shí)間延長(zhǎng)。但對(duì)“延長(zhǎng)”機(jī)制尚缺乏足夠的科學(xué)共識(shí)。

研究表明，惡性瘧原蟲13號(hào)染色體上的Kelch13編碼基因(K13)的突變與瘧原蟲清除時(shí)間延長(zhǎng)密切相關(guān)，這也被認(rèn)為是引發(fā)瘧原蟲對(duì)青蒿素類藥物產(chǎn)生耐藥性的最主要原因。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在東南亞的泰國(guó)、柬埔寨、老撾一些地區(qū)，瘧原蟲清除時(shí)間延長(zhǎng)伴有K13突變，而在東南亞的緬甸、非洲的尼日利亞、剛果共和國(guó)等一些地區(qū)，瘧原蟲清除時(shí)間延長(zhǎng)不伴有K13突變。即使是同時(shí)感染K13突變瘧原蟲的患者，在抗瘧治療過(guò)程中，瘧原蟲的清除時(shí)間也有很大差異[4]。上述研究提示，K13突變并非患者體內(nèi)瘧原蟲清除時(shí)間延長(zhǎng)的必要條件。

由于青蒿素及其衍生物的耐藥概念與傳統(tǒng)藥理學(xué)的耐藥定義內(nèi)涵不一致，而瘧原蟲體內(nèi)清除速率影響因素不僅與病原體自身改變有關(guān)，而且也涉及到宿主機(jī)體狀態(tài)和處理能力相關(guān)。例如脾臟通過(guò)特異性孔蝕功能清除瘧疾患者體內(nèi)的瘧原蟲，在瘧原蟲的清除率中占很大比重，在用青蒿素及其衍生物治療的脾功能正?；颊唧w內(nèi)，這一清除機(jī)制顯得尤為重要。而對(duì)于脾切除患者，在用青蒿素及其衍生物治療后，瘧原蟲的清除時(shí)間會(huì)明顯延長(zhǎng)，這一現(xiàn)象表明脾臟對(duì)于瘧疾患者體內(nèi)的瘧原蟲清除具有重要意義。但是脾臟對(duì)瘧原蟲的清除作用與ACTs治療后出現(xiàn)的瘧原蟲清除時(shí)間延長(zhǎng)即耐藥有無(wú)相關(guān)性，目前尚不明確。此外，患者感染瘧原蟲后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生獲得性免疫，免疫細(xì)胞產(chǎn)生的抗體可與裂殖子表面抗原結(jié)合防止裂殖子入侵紅細(xì)胞；免疫因子調(diào)節(jié)或中和染蟲紅細(xì)胞，促進(jìn)染蟲紅細(xì)胞自身的溶解作用，從而促進(jìn)瘧原蟲的清除。這些功能主要由細(xì)胞色素IgG亞類，IgG1和IgG3介導(dǎo)[5]。同時(shí)機(jī)體的免疫器官脾臟依賴物理生化、免疫功能等同時(shí)發(fā)揮清除瘧原蟲的作用。因此，這里所說(shuō)的青蒿素耐藥(瘧原蟲的體內(nèi)清除時(shí)間延長(zhǎng))與抗瘧藥物對(duì)瘧原蟲的殺傷作用、人體免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用、免疫器官的外排異物功能等具有密切關(guān)系。故本文就青蒿素耐藥性相關(guān)機(jī)制研究與脾臟的濾過(guò)、免疫功能及脾臟對(duì)瘧原蟲的清除機(jī)制等進(jìn)行綜述整理，以期為瘧原蟲對(duì)青蒿素耐藥性的研究提供新的思路和參考。

1 瘧原蟲基因突變及青蒿素耐藥

惡性瘧原蟲K13(Pfkelch13)基因突變被認(rèn)為是瘧原蟲對(duì)青蒿素類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因。

瘧原蟲依賴于消耗染蟲紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白得以生長(zhǎng)與繁殖，在消耗血紅蛋白的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些血紅蛋白降解產(chǎn)物，這些降解產(chǎn)物可激活青蒿素類藥物從而發(fā)揮藥物的殺蟲功效。Birnbaum等[6]發(fā)現(xiàn)Pfkelch13和UBP1、AP-2μ、內(nèi)吞蛋白Eps15等組成與吞噬宿主紅細(xì)胞相關(guān)的內(nèi)吞區(qū)室。Pfkelch13對(duì)于瘧原蟲攝取染蟲紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白至關(guān)重要，該蛋白控制內(nèi)吞作用水平，進(jìn)而影響血紅蛋白降解產(chǎn)物的濃度。如果Pfkelch13發(fā)生變異，血紅蛋白降解產(chǎn)物的濃度降低，導(dǎo)致青蒿素類藥物無(wú)法被充分激活并殺死瘧原蟲。

K13蛋白是Kelch類超家族的726個(gè)氨基酸成員，具有C末端六葉β-螺旋槳結(jié)構(gòu)域、瘧原蟲特異性N末端結(jié)構(gòu)域和BTB/POZ結(jié)構(gòu)域。雖然在Pfkelch13中鑒定出兩百多種非同義突變，但其中只有9種突變被證實(shí)具有體外抗逆轉(zhuǎn)錄病毒能力(F446I、N458Y/I、M476I/V、Y493H、R539T、I543T、P553L、R561H、C580Y)。在柬埔寨地區(qū)，C580Y、Y493H和R539T的突變最為普遍。在中緬邊境，主要是F446I突變，其次是R539T、P574L、N458Y、R561H和A676D[7]。

2 脾臟結(jié)構(gòu)與功能

脾臟位于機(jī)體腹部，在隔膜的正下方，是一個(gè)細(xì)長(zhǎng)的暗紅色器官，被一層纖維膜(支撐較大血管系統(tǒng)的結(jié)締組織)包裹[8]，與胃相鄰，是機(jī)體最大的血液過(guò)濾器，可有效截留并清除血液循環(huán)中的異常紅細(xì)胞，對(duì)于維持機(jī)體正常血液循環(huán)發(fā)揮很重要的作用。也是體內(nèi)最大的次級(jí)淋巴器官，負(fù)責(zé)清除體內(nèi)外來(lái)物質(zhì)和衰老或受損的紅細(xì)胞，同時(shí)引發(fā)血源性抗原的免疫反應(yīng)。

脾臟包含紅髓(red pulp，RP)與白髓(white pulp，WP)兩個(gè)功能性區(qū)域，嚙齒動(dòng)物的這兩個(gè)區(qū)域通過(guò)邊緣區(qū)(marginal zone，MZ)連接，而人類通過(guò)濾泡周圍區(qū)(perifollicular zone，PFZ)連接[9-10]。RP占脾臟的大部分，呈海綿狀結(jié)構(gòu)，充滿著流經(jīng)脾靜脈竇(splenic sinus)和髓束(cords)的血液，該區(qū)域的主要功能是過(guò)濾血液和保護(hù)血液中的鐵循環(huán)。WP占比不到脾臟的25%，卻是脾臟的主要免疫功能區(qū)。

2.1 紅髓的兩條血液循環(huán)通路脾臟無(wú)輸入淋巴管，因此所有細(xì)胞和抗原通過(guò)血液進(jìn)入脾臟。動(dòng)脈血通過(guò)脾動(dòng)脈進(jìn)入脾臟，脾動(dòng)脈在脾臟有許多的中央小動(dòng)脈分支，中央小動(dòng)脈周圍有包含T細(xì)胞區(qū)的動(dòng)脈周圍淋巴鞘(periarteriolar lymphoid sheaths，PALS)。PALS旁邊是B細(xì)胞濾泡。PALS和B細(xì)胞濾泡一起構(gòu)成脾臟的WP，WP被邊緣區(qū)包圍，動(dòng)脈血通過(guò)毛細(xì)血管進(jìn)入MZ。進(jìn)入MZ的80%-90%的血液直接進(jìn)入脾靜脈竇，經(jīng)過(guò)竇后微靜脈，匯入脾靜脈，這條通路稱為快速閉合循環(huán)通路。MZ被濾泡周圍區(qū)域(perifollicular zone，PFZ)包裹，血液流經(jīng)PFZ后，一些血管終止，血液流入由PFZ和RP構(gòu)成的慢速開放循環(huán)通路[11]。脾臟對(duì)血液的濾過(guò)作用就在這條通路中的RP中進(jìn)行。

識(shí)別紅細(xì)胞的大小、形狀、變形性的改變是脾臟的特異性功能，紅髓巨噬細(xì)胞(macrophages，MPs)對(duì)紅細(xì)胞的這些改變具有高度靈敏性。當(dāng)血液進(jìn)入紅髓以后流速減慢，血液會(huì)先與MPs、樹突細(xì)胞(dendritic cells，DCs)等免疫細(xì)胞接觸，MPs識(shí)別并攝取病原體和細(xì)胞碎片以及衰老的紅細(xì)胞等，一些病原體可直接被MPs識(shí)別，但許多病原體首先需要經(jīng)過(guò)“調(diào)理(opsonising)”，在此過(guò)程中，病原體表面被補(bǔ)體或其他脾源性調(diào)理素(促吞噬素，備解素)包裹，這些分子可與巨噬細(xì)胞上的受體相互作用，促使病原體被清除。

Fig 1 Diagram of two blood circulation pathways of spleen[12]

剩余血液要重回血液循環(huán)必須經(jīng)過(guò)脾靜脈竇。脾靜脈竇是由內(nèi)皮細(xì)胞襯里組成，平行定位并通過(guò)應(yīng)力纖維連接到環(huán)狀纖維，形成一個(gè)網(wǎng)狀系統(tǒng)，應(yīng)力纖維的收縮性允許在內(nèi)皮細(xì)胞之間形成間隙，間隙平均長(zhǎng)度和寬度分別為1.89 μm和0.65 μm，硬度是毛細(xì)血管的10倍[12]。剩余血液成分通過(guò)脾靜脈竇的內(nèi)皮細(xì)胞間隙返回血管內(nèi)循環(huán)。紅細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間隙之間不存在配體-受體相互作用，后者通過(guò)物理機(jī)械傳感方式截留異常紅細(xì)胞。紅細(xì)胞通過(guò)該間隙時(shí)，因?yàn)閴毫?，?huì)發(fā)生擠壓變形。正常紅細(xì)胞的細(xì)胞表面面積變化范圍在80-180 μm2，可變?nèi)莘e范圍在60-160 μm3，具有良好的可變形性及恢復(fù)性，通過(guò)較窄毛細(xì)血管時(shí)，會(huì)發(fā)生子彈狀的變形，通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞間隙時(shí)會(huì)發(fā)生啞鈴狀變形，經(jīng)過(guò)這兩種通道后，正常紅細(xì)胞都會(huì)恢復(fù)其原形，且正常功能不會(huì)受損。當(dāng)紅細(xì)胞膜表面積缺損程度≥18%，紅細(xì)胞表面積/體積比值降低≥27%時(shí)，可變形性明顯降低，無(wú)法正常通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞間隙而被截留。正常紅細(xì)胞在老化期間會(huì)發(fā)生表面積損失和可變形性降低。感染病原體的紅細(xì)胞體積腫大，可變性降低而無(wú)法通過(guò)間隙被截留。

正常紅細(xì)胞變形性強(qiáng)，可正常通過(guò)間隙并返回靜脈系統(tǒng)。而變形性異常的紅細(xì)胞會(huì)被截留，通過(guò)MPs或DCs的作用被清除。所以，脾臟在維持血液循環(huán)中的紅細(xì)胞大小、形態(tài)的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用。

被截留的病原體或細(xì)胞碎片，被紅髓巨噬細(xì)胞識(shí)別并清除。紅髓巨噬細(xì)胞與血液?jiǎn)魏思?xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞相反，主要表達(dá)低親和力受體FcγRIIa和FcγRIIIa。不表達(dá)抑制性FcγRIIb受體，而表達(dá)非常低水平的高親和力受體FcγRI[13]。此外，紅髓巨噬細(xì)胞吞噬并溶解異常紅細(xì)胞后，可很好的回收來(lái)自紅細(xì)胞的鐵，促進(jìn)鐵的再循環(huán)。

2.2 白髓的免疫功能在脾動(dòng)脈的中央小動(dòng)脈分支周圍存在T細(xì)胞區(qū)(也稱為小動(dòng)脈周圍淋巴鞘，PALS)和B細(xì)胞區(qū)，這兩個(gè)區(qū)域共同構(gòu)成了脾臟的WP。WP是一個(gè)淋巴區(qū)域，與淋巴結(jié)的結(jié)構(gòu)非常相似，沒(méi)有血流，可啟動(dòng)機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答。

Fig 2 Splenic sinus

WP的功能與維持由特定的趨化因子控制，在淋巴細(xì)胞通過(guò)邊緣區(qū)進(jìn)入白髓時(shí)，這些趨化因子將T細(xì)胞和B細(xì)胞轉(zhuǎn)移到各自的區(qū)域，從而在白髓中建立特定區(qū)域。CXC趨化因子配體13(CXC-chemokine ligand，CXCL13)將B細(xì)胞轉(zhuǎn)移到B細(xì)胞區(qū)，CCL19和CCL21將T細(xì)胞和DCs轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞區(qū)。而且趨化因子受體及其配體對(duì)于T/B細(xì)胞區(qū)的細(xì)胞濃度至關(guān)重要，例如CC趨化因子受體7(CC-chemokine receptor，CCR7)的缺失會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞散亂的分布在脾臟中[14]。這些趨化因子的表達(dá)受淋巴毒素α1β2(LT-α1β2)和腫瘤壞死因子(TNF)的影響。當(dāng)缺少通過(guò)LT-β受體(LT-βR)或TNF受體1(TNFR1)發(fā)出的信號(hào)時(shí)，脾臟中的穩(wěn)態(tài)趨化因子CXCL13、CCL19和CCL21的水平降低，從而導(dǎo)致WP的解體。LT-βR和TNFR1均由抗輻射基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，而它們的配體則由造血細(xì)胞表達(dá)。這些受體被結(jié)合后，核因子κB被激活，從而誘導(dǎo)了各種趨化因子的表達(dá)。CXCL13是由CD35 +卵形樹突狀細(xì)胞(follicular dendritic cells，F(xiàn)DCs)與FDCs相鄰的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的，它對(duì)轉(zhuǎn)移B細(xì)胞到B細(xì)胞區(qū)至關(guān)重要。T細(xì)胞區(qū)中基質(zhì)細(xì)胞和DCs產(chǎn)生的CCL19和CCL21對(duì)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和儲(chǔ)存也至關(guān)重要。在T細(xì)胞區(qū)的發(fā)育過(guò)程中，表達(dá)LTα1β2的B細(xì)胞是基質(zhì)細(xì)胞充分表達(dá)CCL21所必需的[15]。

T/B細(xì)胞兩個(gè)分區(qū)有利于對(duì)外來(lái)和自身抗原作出適當(dāng)?shù)拿庖哒{(diào)節(jié)，B細(xì)胞遇到外來(lái)抗原首先在CXCL13、CCL19和CCL21等一系列趨化因子濃度梯度誘導(dǎo)下遷移至T、B細(xì)胞分界處，在該處T細(xì)胞的幫助下，B細(xì)胞進(jìn)一步分化或返回B細(xì)胞區(qū)。B細(xì)胞區(qū)中含有對(duì)B細(xì)胞活化和存活至關(guān)重要的細(xì)胞混合物，返回該區(qū)域的B細(xì)胞大量增殖和分化，形成B細(xì)胞生發(fā)中心(germinal center，GC)，生發(fā)中心是體液免疫應(yīng)答過(guò)程中B細(xì)胞大量增殖、選擇、消亡的場(chǎng)所。為響應(yīng)同源抗原和T-依賴性B細(xì)胞生發(fā)中心的反應(yīng)，脾臟中的幼稚細(xì)胞和中央記憶T細(xì)胞被激活，從而產(chǎn)生抗體。GC作為體液免疫功能單位，其形成依賴于T/B細(xì)胞區(qū)域邊界的完整性[16]。

2.3 邊緣區(qū)的免疫功能WP由先天免疫細(xì)胞組成的邊界包裹，這個(gè)邊界也稱為邊緣區(qū)(MZ)。邊緣區(qū)域形成了先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答之間的橋梁，MZ含有 MPs、DCs、B細(xì)胞輔助中性粒細(xì)胞(B cell-helper neutrophils ,NBH)、先天性淋巴細(xì)胞3型(innate lymphoid cells type 3，ILC3)、CD4+T淋巴細(xì)胞、MZ B細(xì)胞和記憶B細(xì)胞。該區(qū)域中表達(dá)特定模式識(shí)別受體的MPs可以有效地?cái)z取血源性病原體。MZ B細(xì)胞可以被這些巨噬細(xì)胞激活，或者可以直接識(shí)別血源性病原體，之后它們變成抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cells，APCs)或產(chǎn)生IgM的記憶細(xì)胞。IgM記憶B細(xì)胞是脾臟邊緣區(qū)特有的細(xì)胞群，可產(chǎn)生天然抗體五聚體IgM，這類抗體能夠直接或通過(guò)補(bǔ)體沉積在病原體的包膜上促進(jìn)吞噬，切除脾臟后，機(jī)體IgM記憶B細(xì)胞減少[17]。

3 脾臟清除瘧原蟲的機(jī)制

3.1 免疫清除感染瘧原蟲的紅細(xì)胞與脾臟免疫細(xì)胞的第一次接觸發(fā)生在邊緣區(qū)[18]，邊緣區(qū)的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，具有攝取外來(lái)物質(zhì)并將其呈遞給輔助性T細(xì)胞的能力。由CD11c標(biāo)記物標(biāo)記的樹突狀細(xì)胞在瘧原蟲進(jìn)入血液后5 d內(nèi)從脾臟邊緣區(qū)域遷移到CD4+T細(xì)胞區(qū)域。在同一時(shí)期，樹突狀細(xì)胞中激活T細(xì)胞所必需的CD40、CD54和CD86共刺激因子明顯上調(diào)。這表明，脾臟樹突狀細(xì)胞在瘧疾感染早期的脾臟免疫反應(yīng)階段發(fā)揮重要作用。

在瘧疾感染期間，脾臟對(duì)瘧原蟲的過(guò)度反應(yīng)會(huì)引起脾腫大。以前的研究表明，脾臟中的巨噬細(xì)胞參與免疫反應(yīng)以對(duì)抗瘧疾，在感染期間，脾臟中巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，這些巨噬細(xì)胞可以清除瘧原蟲或感染瘧原蟲的紅細(xì)胞。巨噬細(xì)胞的大量聚集引起脾臟腫大，不僅促使感染紅細(xì)胞的破裂，還會(huì)引發(fā)正常紅細(xì)胞的破裂，造成機(jī)體的嚴(yán)重貧血。髓樣相關(guān)蛋白(myeloid-related protein，MRP)8和MRP14由中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)，有研究表明MRP8+和MRP14+巨噬細(xì)胞的積累與各種炎癥性疾病相關(guān)的病理變化有關(guān)，也被稱為炎性巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物。Haruka研究感染伯氏瘧原蟲的小鼠發(fā)現(xiàn)，小鼠血清中MRP8和MRP14水平升高；感染瘧原蟲的d 7，小鼠脾臟明顯增大，脾臟組織學(xué)分析顯示是瘧色素的沉積和單核細(xì)胞的積累引起，組織的免疫組化學(xué)染色顯示是MRP8+和MRP14+的巨噬細(xì)胞的積累，表明瘧疾期間的脾腫大與MRP8+和MRP14+巨噬細(xì)胞的積累有關(guān)。

哺乳動(dòng)物的中性粒細(xì)胞存在一類表達(dá)TCRαβ組合受體的亞群(5%-8%)。有研究表明，感染伯氏瘧原蟲ANKA株的小鼠，在感染的早期階段誘導(dǎo)脾臟中表達(dá)TCRβ的CD11b+Ly6G+中性粒細(xì)胞擴(kuò)增。在感染后的d 3，表達(dá)TCRβ的中性粒細(xì)胞的比例與外周血的染蟲比例具有顯著相關(guān)性。此外，TCRβ+中性粒細(xì)胞吞噬染蟲紅細(xì)胞的效率比TCRβ-中性粒細(xì)胞高4倍。提示脾臟的中性粒細(xì)胞通過(guò)TCRβ表達(dá)，增強(qiáng)吞噬能力以影響瘧原蟲的感染率[19]。

3.2 孔蝕清除

3.2.1孔蝕的定義 早先發(fā)現(xiàn)脾臟可通過(guò)物理方式截留瘧原蟲，Schnitzer等1972年研究感染諾氏瘧原蟲(Plasmodiumknowlesi，Pk)的猴子，在未給藥的情況下，利用電鏡技術(shù)觀察感染猴的脾臟切片，發(fā)現(xiàn)脾臟中有一部分染蟲紅細(xì)胞(iRBCs)從髓束通過(guò)靜脈竇壁進(jìn)入竇腔的過(guò)程中發(fā)生擠壓變形，iRBCs的不含瘧原蟲的部分進(jìn)入竇腔，含瘧原蟲的部分被截留在髓束，兩者通過(guò)一條細(xì)長(zhǎng)的莖條狀物質(zhì)連接。因?yàn)閴毫ΓB接兩者的莖條容易斷裂，斷裂以后，截留在髓束的染蟲部分被巨噬細(xì)胞吞噬；進(jìn)入竇腔的部分恢復(fù)成“紅細(xì)胞”，這種細(xì)胞被稱為“曾經(jīng)染蟲紅細(xì)胞”(O-iRBCs，也有稱為含有環(huán)狀期感染紅細(xì)胞表面抗原的RESA-RBCs，本文均以前者名統(tǒng)稱)，并將這一過(guò)程稱為“孔蝕(pitting)”，提出脾臟通過(guò)孔蝕清除血液中的瘧原蟲[20]。以后一些學(xué)者進(jìn)一步佐證了Schnitzer等的發(fā)現(xiàn)，將“孔蝕”明確表述為：感染瘧原蟲的紅細(xì)胞從髓束穿過(guò)靜脈竇壁進(jìn)入竇腔的過(guò)程中，紅細(xì)胞內(nèi)的瘧原蟲被截留而不破壞紅細(xì)胞的形態(tài)，被感染過(guò)的紅細(xì)胞可重新返回血液循環(huán)。

同時(shí)巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的異質(zhì)群體在紅髓內(nèi)形成吞噬網(wǎng)絡(luò)，負(fù)責(zé)瘧原蟲殘余物的清除工作。

3.2.2孔蝕的檢測(cè) 在惡性瘧原蟲的裂殖子中存在一種顆粒，這些顆粒在裂殖子侵入紅細(xì)胞以后被釋放，并且沉積在染蟲紅細(xì)胞的細(xì)胞膜中，該顆粒被稱為環(huán)狀體感染的紅細(xì)胞表面抗原(ring erythrocyte surface antigen，RESA)。RESA在瘧原蟲侵入紅細(xì)胞以后，固定表達(dá)在紅細(xì)胞膜表面，可充當(dāng)瘧原蟲感染紅細(xì)胞的足跡。

在人體脾臟的紅髓，惡性瘧原蟲被擠出iRBCs以后，O-iRBCs會(huì)進(jìn)入血液循環(huán)。利用瘧原蟲DNA與RESA雙染色法區(qū)分iRBCs(RESA陽(yáng)性、DNA陽(yáng)性)與O-iRBCs(RESA陽(yáng)性、DNA陰性)，只有正常瘧疾患者的血液涂片中能觀察到RESA陽(yáng)性DNA陰性的紅細(xì)胞，在惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)與脾切除患者的血液涂片中未發(fā)現(xiàn)RESA陽(yáng)性DNA陰性的紅細(xì)胞[21]。利用這種標(biāo)記方法，可以更有效研究脾臟的孔蝕發(fā)生率。尤其是抗瘧治療前后或不同藥物治療后，孔蝕發(fā)生率之間的差異。

綜上所述，骨關(guān)節(jié)結(jié)核在發(fā)生與發(fā)展的過(guò)程中，伴隨著機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化，IL-15、MCP-1和TGF-β含量顯著增高，提示其可能參與骨關(guān)節(jié)結(jié)核的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，但其具體機(jī)制尚未明確，有待深入研究。IL-15、MCP-1和TGF-β的表達(dá)水平有望成為骨關(guān)節(jié)結(jié)核的預(yù)防、診斷、病情監(jiān)測(cè)及判斷預(yù)后的重要臨床參考指標(biāo)。

但現(xiàn)階段，只確證了惡性瘧原蟲固定表達(dá)在人體iRBCs膜上的蛋白，伯氏、約氏等其他種類瘧原蟲固定表達(dá)在iRBCs膜上的蛋白還有待進(jìn)一步研究。

4 影響孔蝕的因素

眾多實(shí)驗(yàn)表明，脾臟的孔蝕與瘧原蟲的生長(zhǎng)周期、染蟲紅細(xì)胞膜的剛性(或稱可變形性、柔韌度)、粘附性、滲透性、抗原性、微結(jié)構(gòu)以及使用的抗瘧藥物有關(guān)。

4.1 瘧原蟲生長(zhǎng)周期感染瘧原蟲的紅細(xì)胞預(yù)先暴露于青蒿琥酯致死劑量中8-12 h，離體灌注人體脾臟。組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)不同的截留形式：① 環(huán)狀體期的瘧原蟲被完全擠出iRBCs，宿主紅細(xì)胞可進(jìn)入脾靜脈；② 早期滋養(yǎng)體的瘧原蟲一部分被擠出iRBCs，其余部分通過(guò)絲狀或啞鈴狀仍與其宿主紅細(xì)胞相連，但宿主紅細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生擠壓變形并通過(guò)了內(nèi)皮細(xì)胞間隙。③ 晚期滋養(yǎng)體期iRBCs的柔韌性喪失，在通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞間隙時(shí)，紅細(xì)胞破裂或完全被截留。④ 裂殖體期的iRBCs被完全截留在紅髓。

這一現(xiàn)象與瘧原蟲的生長(zhǎng)周期有關(guān)。惡性瘧原蟲裂殖子侵入紅細(xì)胞以后，在iRBCs中形成的液泡中經(jīng)過(guò)環(huán)、滋養(yǎng)體及裂殖體期的變形階段，最終紅細(xì)胞破裂釋放16-32個(gè)裂殖子。此循環(huán)需要48 h，在這個(gè)變化過(guò)程中，宿主紅細(xì)胞的體積、柔韌性、粘附性和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滲透性也會(huì)隨之變化[22]。

4.1.1環(huán)狀體期 環(huán)狀瘧原蟲為單核，在iRBCs內(nèi)呈變形蟲形態(tài)，瘧原蟲體積<10 μm3，完全被iRBCs細(xì)胞質(zhì)所包圍，瘧原蟲與iRBCs之間沒(méi)有聯(lián)系膜，iRBCs的體積為92.6±5.1 μm3，此時(shí)iRBC細(xì)胞膜的柔韌性沒(méi)有明顯變化。

4.1.2滋養(yǎng)體期 滋養(yǎng)體階段瘧原蟲擴(kuò)大并變圓，iRBCs的表面變得不規(guī)則，瘧原蟲的細(xì)胞體和細(xì)胞核增大膨脹，在瘧原蟲的細(xì)胞質(zhì)中形成含有血紅蛋白晶體的消化液泡，扁平的頂質(zhì)體存在于細(xì)胞核和消化液泡之間的線粒體附近，瘧原蟲體積≥10 μm3。同時(shí)染蟲紅細(xì)胞的表面開始出現(xiàn)突起(Knobs)，這個(gè)突起是由Var多基因家族轉(zhuǎn)錄而成，在iRBCs的膜表面表達(dá)的一類高分子量、具有抗原多樣性、由瘧原蟲編碼的惡性瘧原蟲紅細(xì)胞膜蛋白(PfEMP1；一個(gè)蛋白質(zhì)家族的簡(jiǎn)稱，含有多種略有差異的蛋白質(zhì)群)，不同結(jié)構(gòu)的PfEMP1可以和不同的宿主受體結(jié)合，主要有CD36、細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1(ICAM-1)或血管內(nèi)皮細(xì)胞。iRBCs的粘附性是在感染瘧原蟲的16 h后出現(xiàn)，瘧原蟲是在滋養(yǎng)體期開始表達(dá)PfEMP1，這也可以解釋iRBCs的粘附性與PfEMP1的調(diào)節(jié)有關(guān)。瘧原蟲編碼的骨架結(jié)合蛋白1(SBP1)，是一種跨膜蛋白，位于瘧原蟲誘導(dǎo)的染蟲紅細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Maurer′s 裂縫(MCs；國(guó)內(nèi)將它稱為“茂氏裂縫”或“茂氏裂”)，該蛋白參與PfEMP1在紅細(xì)胞表面的表達(dá)過(guò)程，這在染蟲紅細(xì)胞表達(dá)粘附性的過(guò)程中至關(guān)重要。單圓盤形的膜形結(jié)構(gòu)(Maurer′s裂縫)分散存在于紅細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，但是不直接接觸iRBCs膜和瘧原蟲液泡膜。iRBCs的體積為104.8±9.1 μm3。此時(shí)，iRBCs細(xì)胞的剛性增加。

在晚期滋養(yǎng)體階段，iRBCs的體積進(jìn)一步增大，由于瘧原蟲攝取了大量紅細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，紅細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的體積會(huì)減小，瘧原蟲出現(xiàn)多個(gè)未分裂的核體，在消化液泡中會(huì)出現(xiàn)成簇的血紅蛋白晶體。iRBCs膜表面的突起仍然存在，數(shù)量要比早期滋養(yǎng)體階段多。而Maurer′s裂縫的數(shù)量逐漸較少。

4.1.3裂殖體期 在裂殖體階段，瘧原蟲是多核且分裂的。瘧原蟲占據(jù)了iRBCs體積的大部分，在iRBCs表面有突出的球形突起，瘧原蟲的頂質(zhì)體、線粒體也已完成復(fù)制，平分到每個(gè)裂殖子中。消化液泡被裂殖子包圍，iRBCs的體積為101.1±8.5 μm3。此時(shí)的iRBCs已經(jīng)完全失去其原生形態(tài)。

脾靜脈竇的內(nèi)皮細(xì)胞間隙平均長(zhǎng)度和寬度分別為1.89 μm和0.65 μm。瘧原蟲自身柔韌性很差，一般無(wú)法正常通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞間隙。正常紅細(xì)胞具有典型的雙凹圓盤形[23]，具有很強(qiáng)的柔韌性。瘧原蟲處于早期環(huán)狀體階段時(shí)，iRBCs的形狀和柔韌性與正常紅細(xì)胞無(wú)明顯差異，在經(jīng)過(guò)脾靜脈竇壁時(shí)，iRBCs內(nèi)的瘧原蟲被擠出，O-iRBCs返回血液循環(huán)；隨著瘧原蟲的發(fā)育，紅細(xì)胞的雙凹狀逐漸變?yōu)榍驙頪24]，iRBCs的體積、剛性增加，可通過(guò)脾靜脈竇內(nèi)皮細(xì)胞間隙的iRBCs逐漸減少，滋養(yǎng)體、裂殖體更容易被脾臟隔離。由此可知孔蝕一般是發(fā)生在瘧原蟲的環(huán)狀體時(shí)期[25]。

環(huán)狀階段的iRBCs沒(méi)有粘附性，滋養(yǎng)體、裂殖體階段的 iRBC的剛性和粘附性增加導(dǎo)致微血管系統(tǒng)的血液動(dòng)力學(xué)阻力增加，這在瘧疾的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

4.2 青蒿素類藥物已有研究資料提示，不同抗瘧藥物對(duì)不同類型的瘧原蟲(如惡性瘧、間日瘧)對(duì)脾清除染蟲紅細(xì)胞，具有不同影響。就孔蝕的作用而論，Wojnarski[26]通過(guò)臨床觀察發(fā)現(xiàn)，口服以蒿甲醚-苯芴醇或雙氫青蒿素-哌喹的復(fù)合療法(ACT)的患者，孔蝕檢出率高達(dá)55.8%，使用奎寧、甲氟喹、阿托伐醌-氯脈等非青蒿素類藥物的孔蝕檢出率均低于10%，認(rèn)為青蒿素類藥物在清除iRBCs過(guò)程中，具有孔蝕依賴性。

Chotivanich等[27]探討青蒿琥酯和奎寧治療急性瘧疾患者血液中的瘧原蟲清除機(jī)制，發(fā)現(xiàn)兩者既不降低iRBCs的可變形性，也不增加其抗體結(jié)合力，而且可提高孔蝕的發(fā)生率：在無(wú)并發(fā)癥的瘧疾患者接受青蒿琥酯治療的24 h內(nèi)，O-iRBCs數(shù)量顯著升高，用奎寧治療患者體內(nèi)的O-iRBCs數(shù)量升高非常緩慢(7 d)；在重癥患者，接受青蒿琥酯治療的數(shù)小時(shí)內(nèi)O-iRBCs數(shù)量顯著升高，接受奎寧的并不呈現(xiàn)。對(duì)于單純性瘧疾和兒童瘧疾患者，青蒿琥酯治療組的孔蝕發(fā)生率也大于奎寧治療組。對(duì)于這一現(xiàn)象的推測(cè)可能是孔蝕主要發(fā)生在瘧原蟲的環(huán)狀體時(shí)期，青蒿素類藥物作用于瘧原蟲生長(zhǎng)過(guò)程中的每個(gè)階段，像奎寧、甲氟喹等非青蒿素類藥物，主要是作用于瘧原蟲生長(zhǎng)過(guò)程中的成熟階段，對(duì)環(huán)狀體時(shí)期的瘧原蟲藥效不大。氯喹還可增加iRBC的剛性，降低iRBC在內(nèi)皮細(xì)胞間隙的通過(guò)率。因此青蒿素類藥物對(duì)孔蝕的影響更明顯。

此外，嚴(yán)重瘧疾患者出現(xiàn)的延遲性貧血與孔蝕發(fā)生率有關(guān)。嚴(yán)重的瘧疾患者進(jìn)行抗瘧治療時(shí)，紅細(xì)胞大量死亡，一般在7 d以內(nèi)會(huì)有貧血現(xiàn)象，表現(xiàn)為血紅蛋白降低10%以上，延遲性貧血是指血紅蛋白值的這個(gè)降低過(guò)程發(fā)生在開始治療8 d后。統(tǒng)計(jì)分析這些病例，發(fā)現(xiàn)這些病例中，用青蒿琥酯進(jìn)行治療的患者居多，在21名用青蒿琥酯治療的嚴(yán)重瘧疾患者中有12名患者發(fā)生延遲性貧血，而且孔蝕率越高，患者更容易出現(xiàn)延遲性貧血。因此提出了青蒿琥酯會(huì)引發(fā)嚴(yán)重瘧疾患者的延遲性貧血。對(duì)于這一現(xiàn)象的推測(cè)是，青蒿素類藥物會(huì)升高孔蝕的發(fā)生率，使得更多的O-iRBCs返回血液循環(huán)，但是這些紅細(xì)胞的細(xì)胞膜已經(jīng)是受損的狀態(tài)，利用高速成像流式細(xì)胞儀記錄并分析正常RBCs、iRBCs和O-iRBCs的表面積發(fā)現(xiàn)，iRBCs的表面積大約是正常RBCs表面積的97.1%，O-iRBCs的表面積是正常RBCs表面積的91.1%，返回血液循環(huán)的O-iRBCs因?yàn)榧?xì)胞膜受損嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)外漏，壽命要比正常RBCs大幅縮短(正常RBCs平均壽命為1 027 h，O-iRBCs的平均壽命為183 h)，雖然嚴(yán)重瘧疾患者在用青蒿琥酯治療初期不會(huì)發(fā)生貧血，但是8 d后，返回血液循環(huán)的O-iRBCs會(huì)大量死亡，所以貧血現(xiàn)象會(huì)延遲[28]。

一般認(rèn)為，血液循環(huán)中的感染瘧原蟲的紅細(xì)胞通過(guò)脾臟和吞噬細(xì)胞兩大系統(tǒng)進(jìn)行消除。Aogo等[29]通過(guò)伯氏瘧原蟲感染小鼠以及用氯屈膦酸鹽脂質(zhì)體耗竭吞噬細(xì)胞系統(tǒng)等實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為兩大系統(tǒng)在清除血流中染蟲紅細(xì)胞的作用大體各占一半；而青蒿琥酯的作用主要抑制瘧原蟲的復(fù)制，對(duì)誘導(dǎo)清除的作用似乎不大。

綜之，由于相關(guān)研究尚待深入，目前依然存在人類脾臟在瘧疾中的作用是“過(guò)濾器”還是“庇護(hù)所”的不同議論[30]。但從已有臨床和實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，脾臟通過(guò)免疫和物理等途徑，在消除紅細(xì)胞內(nèi)的瘧原蟲上起著相當(dāng)重要的角色。至于被截留在脾內(nèi)的裂殖體和配子母細(xì)胞成為復(fù)燃的種子，尚缺乏足夠事實(shí)依據(jù)。

5 小結(jié)與展望

ACTs三日療法是瘧疾的一線治療方法，但近年出現(xiàn)ACTs治療3 d后，血液內(nèi)仍存有瘧原蟲的病例報(bào)道，由此提出把血液中瘧原蟲清除時(shí)間延長(zhǎng)判斷為瘧原蟲對(duì)青蒿素類藥物產(chǎn)生了耐藥性。但現(xiàn)階段對(duì)“延長(zhǎng)”機(jī)制尚缺乏足夠的科學(xué)共識(shí)，揭示“清除時(shí)間延長(zhǎng)”的真諦，有助于澄清對(duì)青蒿素耐藥性問(wèn)題的異議。瘧原蟲的體內(nèi)清除速率不僅與瘧原蟲本身的變異、與抗瘧藥物的作用機(jī)制有關(guān)，還受人體免疫和吞噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用、免疫器官的外排異物等功能的影響。其中人體最大的血液過(guò)濾器及次級(jí)淋巴器官脾臟就參與了機(jī)體清除瘧原蟲的工作。

脾臟通過(guò)特異性孔蝕這一物理過(guò)程截留血液中的瘧原蟲，結(jié)合紅髓中免疫細(xì)胞特異性吞噬瘧原蟲和紅細(xì)胞碎片這一生化過(guò)程加速清除血液中的瘧原蟲?？孜g主要發(fā)生在瘧原蟲的環(huán)狀體時(shí)期，處于滋養(yǎng)體期和裂殖體期的染蟲紅細(xì)胞會(huì)被完全截留在紅髓中。青蒿素類藥物作用于紅內(nèi)期瘧原蟲生長(zhǎng)過(guò)程中的每個(gè)階段，而非青蒿素類藥物主要是作用于瘧原蟲生長(zhǎng)過(guò)程中的成熟階段，所以青蒿素類藥物對(duì)孔蝕發(fā)生率的影響更大。

脾臟的血液濾過(guò)功能在機(jī)體清除瘧原蟲的過(guò)程中產(chǎn)生多大的貢獻(xiàn)，還無(wú)法判斷。脾臟紅髓中的免疫細(xì)胞對(duì)被截留的染蟲紅細(xì)胞或瘧原蟲的識(shí)別方式，配體-受體的結(jié)合方式仍不清楚。截留在紅髓中的瘧原蟲還有無(wú)復(fù)染的可能、瘧原蟲的“青蒿素耐藥”這一說(shuō)法與脾切除后引起的瘧原蟲清除時(shí)間延長(zhǎng)之間的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。青蒿素自身對(duì)脾臟功能有無(wú)影響，脾靜脈竇的內(nèi)皮細(xì)胞間隙在病理狀態(tài)下的血液濾過(guò)機(jī)制如何改變還不清楚。研究這些問(wèn)題可為了解脾臟清除瘧原蟲機(jī)制、脾臟對(duì)抗瘧藥物抗瘧作用的貢獻(xiàn)度提供科研基礎(chǔ)；同時(shí)，也可為另一些以紅細(xì)胞為寄主的其他人畜共患的病原體如牛羊的邊蟲病、犬巴貝斯蟲病等的消除，提供借鑒。