五味子-甘草配伍的含藥血清對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響及機(jī)制研究

賈文匯，李偉霞，張 輝，張明亮，牛 璐，王 炎，泥文娟，王曉艷，唐進(jìn)法

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450008；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，中藥臨床評(píng)價(jià)技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000)

五味子SchisandraeChinensisFructus系木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí)，具有收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心等作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，五味子中活性最強(qiáng)的聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素—五味子素B(schisandrin B，Sch B)一次大劑量(0.1-2 g·kg-1)給藥，在一定時(shí)間內(nèi)(12-96 h)與臨床高脂血癥-脂肪肝-肝損傷的發(fā)病過(guò)程極為接近[2-4]。臨床上所用五味子劑量較大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了五味子的推薦劑量，致使五味子存在誘發(fā)高脂血癥及脂代謝紊亂相關(guān)疾病的潛在風(fēng)險(xiǎn)。甘草味甘、性平，可緩和諸藥之偏性，還能緩急止痛，顧護(hù)肝臟之氣血，有“解毒之王”的譽(yù)稱[5]。臨床上含五味子的中藥方劑，多數(shù)亦含甘草，如桂苓五味甘草湯(五味子：甘草=1 ∶1)、小青龍湯(五味子：甘草=1 ∶1)、養(yǎng)陰益氣湯(五味子：甘草≈1 ∶1.5)等，臨床上應(yīng)用上述方劑未發(fā)現(xiàn)脂代謝紊亂等現(xiàn)象，或與甘草的“解毒”作用有關(guān)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大劑量五味子(3.9 g·kg-1)可顯著升高血清TG和TC含量，而配伍甘草后，可顯著降低五味子升高的血清TG和TC含量，說(shuō)明大劑量五味子配伍甘草可降低五味子致脂代謝紊亂、誘發(fā)高脂血癥和脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)，但其機(jī)制尚不清楚。脂質(zhì)代謝的調(diào)控是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，肝臟的脂肪沉積與肝臟脂肪的攝取和分解失衡有關(guān)[6]，涉及多個(gè)環(huán)節(jié)、多條通路、多個(gè)作用靶點(diǎn)，包括過(guò)氧化物酶體增生物激活受體α/γ(PPAR-α/γ)、脂肪酸結(jié)合蛋白1/2(Fabp1/2)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合因子-1(SREBF1)、脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)等，據(jù)此，本研究旨在通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察大劑量五味子含藥血清及配伍甘草后含藥血清對(duì)正常肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的影響，并初步探討其相關(guān)機(jī)制，為五味子的臨床合理應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，型號(hào)：3111)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；酶標(biāo)儀(Thermo賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；倒置相差顯微鏡(Motic麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，型號(hào)：AE31)；-80 ℃超低溫冰箱(Thermo賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，型號(hào)：Revco Value ULT1386-3-V42)；熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司，型號(hào)：LightCycler 96);細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)康寧公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，型號(hào)：S11)；離心機(jī)(Thermo賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，型號(hào)：Megafuge 8)。

1.2 藥物與試劑五味子(批號(hào)：19060102)，甘草(批號(hào)：19080101)均購(gòu)自鄭州瑞龍制藥股份有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳天朝主任藥師鑒定，符合《中國(guó)藥典》2015版一部相關(guān)規(guī)定。PBS(批號(hào)：PYGOO21)購(gòu)自博斯特生物技術(shù)有限公司；DMSO(批號(hào)：1213C0330)、青鏈霉素混合液(批號(hào)：20190320)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清(批號(hào)：NYMI1035)、胰酶(批號(hào)：J170003)、DMEM(批號(hào)：AL209346)均購(gòu)自HyClone公司；CCK8(批號(hào)：NG703)購(gòu)自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測(cè)試盒(批號(hào)：20190425)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)測(cè)試盒(批號(hào)：20190615)、總蛋白定量測(cè)試盒(BCA法)(批號(hào)：20200411)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 動(dòng)物與細(xì)胞SD大鼠80只，♂，體質(zhì)量(200±20) g，SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：YFYDW2019006)。飼養(yǎng)環(huán)境恒溫控制，溫度(22±1) ℃，濕度0.6，12 h暗/光周期，自由攝食飲水。動(dòng)物操作過(guò)程均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的規(guī)定由專職飼養(yǎng)員嚴(yán)格執(zhí)行。人正常L02肝細(xì)胞由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、給藥及含藥血清制備根據(jù)小青龍湯和養(yǎng)陰益氣湯中五味子和甘草的比例，設(shè)置五味子-甘草(1 ∶1)和五味子-甘草(1 ∶1.5)組，將SD大鼠80只隨機(jī)平均分為空白對(duì)照組(Control)、五味子組(SchisandraeChinensisFructus，SF)、五味子-甘草(1 ∶1)和五味子-甘草(1 ∶1.5)組(SchisandraeChinensisFructus-GlycyrrhizaeRadixEtRhizoma，SG，1 ∶1，1 ∶1.5)，空白組給予羧甲基纖維素鈉溶液，各給藥組給予各提取物含五味子生藥3.9 g·kg-1，每天灌胃一次，連續(xù)7 d，末次給藥1 h后，0.1水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉，腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置2 h后，3 500 r·min-1離心10 min(4 ℃)，分離血清，將同組含藥血清合并，56 ℃熱處理30 min進(jìn)行滅活，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，分裝凍存。

2.2 L02細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇后用含0.1胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮接種，置于37 ℃、0.05 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度占0.8時(shí)，用0.002 5胰蛋白酶消化，按1 ∶3比例傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 CCK-8法確定大鼠血清加入量取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L02細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/孔(100 μL)接種于96孔培養(yǎng)板，用無(wú)血清的培養(yǎng)液同步化細(xì)胞16 h后，分別加入含0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3空白大鼠血清和0.1胎牛血清的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入60 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育1 h左右，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm光吸收值。

2.4 LDH法檢測(cè)含藥血清對(duì)細(xì)胞的毒性按照上述步驟接種并同步化細(xì)胞后分為以下五組：0.1胎牛血清組、0.25空白大鼠血清組、0.25 SF含藥血清組、0.25 SG(1 ∶1)含藥血清組和0.25 SG(1 ∶1.5)含藥血清組。干預(yù)24 h和48 h后，吸取各培養(yǎng)液上清，用酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度。

2.5 分組待細(xì)胞融合分布0.7-0.8后，采用無(wú)血清培養(yǎng)液同步化細(xì)胞16 h，將細(xì)胞分為以下4組：①Control組(含0.25大鼠空白血清培養(yǎng)液)；②SF組(含0.25大鼠SF含藥血清培養(yǎng)液)；③SG(1 ∶1)組(含0.25大鼠SG(1 ∶1)含藥血清培養(yǎng)液)；④SG(1 ∶1.5)組(含0.25大鼠SG(1 ∶1.5)含藥血清培養(yǎng)液)。各組細(xì)胞給予相應(yīng)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)干預(yù)48 h后進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

2.6 TG、TC含量測(cè)定細(xì)胞分組同“2.5”項(xiàng)，含藥血清培養(yǎng)作用48 h后，采用0.02 Triton-X100冰上裂解細(xì)胞，離心取上清，參照試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG、TC的含量。

2.7 RT-PCR法檢測(cè)脂代謝相關(guān)指標(biāo)(PPAR-α、PPAR-γ、Fabp1/2、SREBP1c、ACCα、FAS)mRNA的表達(dá)情況各組細(xì)胞無(wú)血清同步化處理16 h，給藥刺激48 h后，收集細(xì)胞按RNA提取試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA，再以此cDNA為模板按PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。使用2-ΔΔct法分析目的基因的表達(dá)，其中Ct代表循環(huán)閾值。各基因引物序列見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Primer sequence

3 結(jié)果

3.1 大鼠血清加入量CCK-8結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h的0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3空白大鼠血清組與0.1胎牛血清組吸光度值(OD)比較無(wú)明顯差異。培養(yǎng)48 h的0.1、0.25和0.3空白大鼠血清組與0.1胎牛血清組OD值比較無(wú)明顯差異，而0.25的空白大鼠血清組與0.1胎牛血清組OD值最為接近。綜合考慮后續(xù)分組實(shí)驗(yàn)選擇0.25大鼠血清為實(shí)驗(yàn)終配比。

3.2 含藥血清對(duì)細(xì)胞的毒性檢測(cè)(LDH)活力LDH結(jié)果顯示，與0.1胎牛血清組比較，Control、SF、SG (1 ∶1、1 ∶1.5)組大鼠含藥血清對(duì)細(xì)胞LDH活性的影響均無(wú)顯著差異，說(shuō)明含藥血清對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用，見(jiàn)Tab 2。綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)作用時(shí)間選擇48 h。

Tab 2 Effect of serum containing drugs on LDH activity of L02 cells(,n=6)

3.3 TG和TC含量作用48 h后，與空白組比較，SF組TG、TC含量顯著增加(P<0.05)；與SF組比，SG(1 ∶1)組的TG、TC均顯著降低(P<0.05)，SG(1 ∶1.5)組TC含量顯著降低(P<0.05)，SG(1 ∶1.5)組TG含量有降低的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)Fig 2。

Fig 1 Effects of different concentrations of rat serum on proliferation of L02 cells(,n=6)*P<0.05 vs 0.1 FBS

Fig 2 Effects of serum containing drugs on contents of TG and TC in L02 cells(,n=6)*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs SF

3.4 含藥血清對(duì)L02細(xì)胞脂代謝相關(guān)指標(biāo)(PPAR-α、PPAR-γ、Fabp1/2、SREBP1c、ACCα 、FAS)mRNA表達(dá)的影響與空白組比較，SF可顯著降低PPAR-α、PPAR-γ的mRNA表達(dá)，升高SREBP1c、ACCα的mRNA表達(dá)(P<0.05，P<0.01)；與SF比較，SG(1 ∶1)可顯著降低Fabp1/2、FAS的mRNA表達(dá)，升高SREBP1c的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)；SG(1 ∶1.5)可顯著升高PPAR-γ、SREBP1c的mRNA表達(dá)，降低Fabp1/2、FAS的mRNA表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)Fig 3。

Fig 3 Effects of serum containing drugs on mRNA expression of lipid metabolism related protein in L02 cells(,n=6)*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs SF

4 討論

中醫(yī)素有“不傳之秘在于量”的說(shuō)法，中藥劑量是影響療效的關(guān)鍵因素之一，也是中藥是否產(chǎn)生不良反應(yīng)的重要因素。許多統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)臨床處方中很多藥物存在超劑量使用收獲良效的驗(yàn)案，但同時(shí)超大劑量及長(zhǎng)期使用而引起的中藥不良事件時(shí)有發(fā)生。張文東[7]整理某院烏頭類中藥的不良反應(yīng)，因超劑量使用烏頭類藥物導(dǎo)致患者出現(xiàn)不良反應(yīng)，約占不良反應(yīng)總數(shù)的0.26。此外，部分中藥的功效會(huì)隨著應(yīng)用劑量的不同而發(fā)生改變，甚至作用完全相反，即所謂的“雙向調(diào)節(jié)”。如川芎小劑量可使子宮張力增高，收縮力增強(qiáng)、形成攣縮；大劑量反而使子宮麻痹而收縮停止[8]。

現(xiàn)代研究表明，五味子在中樞系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、腎臟和生殖系統(tǒng)等方面應(yīng)用廣泛，具有保護(hù)肝臟、抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降血脂和抗炎等作用，并有研究表明五味子具有“適應(yīng)原”樣作用[9]。藥典中規(guī)定五味子用量2-6 g，有文獻(xiàn)報(bào)道建議成人五味子劑量為0.5-1.5 g，每天2次[10]，相當(dāng)于五味子中含量最高的Sch B每天20-60 mg[11]。研究發(fā)現(xiàn)，低劑量五味子醇提物可降低高膽固醇血癥小鼠血清和肝臟TG含量[12]，高劑量五味子可升高正常小鼠血TG和TC含量，說(shuō)明五味子在調(diào)節(jié)血脂方面存在“雙向調(diào)節(jié)”作用。

高脂血癥進(jìn)一步可誘發(fā)脂肪肝[13]，脂肪肝主要表現(xiàn)為脂質(zhì)的堆積，即TG和TC含量的升高。課題組前期證實(shí)五味子提取物大劑量可顯著升高正常小鼠的血清和肝臟中TG和TC含量，誘發(fā)高脂血癥，本次研究結(jié)果表明，SF含藥血清組TG、TC含量較對(duì)照組均顯著上升，而與SF組比，SG組的TG、TC的含量均有所下調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了甘草與五味子配伍可顯著降低大劑量五味子誘發(fā)的脂質(zhì)堆積，但未呈劑量依賴性。

與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因PPAR-α是參與過(guò)氧化物酶體和線粒體β-氧化、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和肝葡萄糖生成的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要通過(guò)影響脂蛋白及長(zhǎng)鏈脂肪酸的代謝，進(jìn)而調(diào)控脂質(zhì)代謝。PPAR-γ可以調(diào)控脂肪酸從頭合成、延長(zhǎng)、去飽和、酯化過(guò)程的每一個(gè)步驟，并已證實(shí)脂肪肝發(fā)生與PPAR-γ的表達(dá)呈正相關(guān)[14]。肝細(xì)胞特異性高表達(dá)PPAR-γ可促進(jìn)甘油三酯的蓄積。研究結(jié)果表明，SF、SG均能抑制脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和脂肪生成基因的表達(dá)，可能是五味子及配伍甘草降低TG、TC的機(jī)制之一。

FABP是一類脂肪酸結(jié)合蛋白，肝細(xì)胞特異性的FABP形式是Liver FABP(L-FABP)，其負(fù)責(zé)部分脂肪酸的攝取，不過(guò)最主要的功能是和細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸結(jié)合[15]，它高表達(dá)也會(huì)促進(jìn)甘油三酯及磷脂的合成。另外，L-FABP還可激活膽固醇脂酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的合成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SF組Fabp1/2基因的表達(dá)有升高趨勢(shì)，高劑量五味子可能通過(guò)上調(diào)Fabp1/2基因，導(dǎo)致了TG、TC含量升高，而配伍甘草后，下調(diào)Fabp1/2基因的表達(dá)，從而降低了TG、TC的合成。

SREBP1c可激活脂肪酸合成途徑，F(xiàn)AS和ACC是脂肪酸從頭合成的酶，都是調(diào)節(jié)肝臟脂肪生成的關(guān)鍵基因。文獻(xiàn)報(bào)道[16]，沉默SREBP1c的表達(dá)可降低脂肪肝的發(fā)生率，同時(shí)抑制FAS和ACC基因的表達(dá)。SREBP1c表達(dá)增加會(huì)促進(jìn)脂肪生成基因的表達(dá)，使脂肪酸合成增加并且加速甘油三酯的蓄積；據(jù)研究證明[17]，F(xiàn)AS可通過(guò)催化脂肪再生使肝臟產(chǎn)生大量游離脂肪酸，F(xiàn)AS的活性和數(shù)量增加會(huì)使動(dòng)物機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)的生成與沉積；ACC表達(dá)量升高會(huì)使肝臟脂肪酸的從頭合成與攝取增加。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SF組SREBP1c、ACCα的表達(dá)顯著升高，說(shuō)明高劑量五味子可能通過(guò)上調(diào)SREBP1c、ACCα基因的表達(dá)，導(dǎo)致脂肪蓄積，配伍甘草后仍呈上升趨勢(shì)，但TG、TC含量呈顯著下降；與對(duì)照組比，SF組FAS的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，而加入甘草配伍后顯著抑制了FAS的表達(dá)，降低了脂質(zhì)合成堆積，充分說(shuō)明中藥通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路作用的特點(diǎn)。

本研究通過(guò)比較高劑量五味子與加入甘草配伍后的含藥血清對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響，證實(shí)了高劑量五味子含藥血清可顯著升高肝細(xì)胞中TG、TC含量，造成脂質(zhì)堆積，而配伍甘草后能顯著降低TG、TC的含量，降低脂質(zhì)堆積，其機(jī)制可能與調(diào)控PPAR-α、PPAR-γ、Fabp1/2、SREBP1c、ACCα、FAS基因的表達(dá)有關(guān)。因此，臨床應(yīng)用五味子時(shí)需對(duì)其用藥劑量慎重考慮，建議配伍同等劑量的甘草，避免其在脂肪代謝方面的“雙向調(diào)節(jié)”作用，為五味子的臨床合理應(yīng)用提供參考依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥臨床評(píng)價(jià)技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室、中藥藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，感謝各位老師和同學(xué)的幫助。)