免疫檢查點抑制劑與抗血管生成藥物合用治療腫瘤的研究進展

鄭維維，錢 程，鄒 偉，楊春媚，張 珊，王愛云,2，陸 茵,2，吳媛媛,2

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 1．藥學(xué)院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，2． 江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

免疫檢查點主要包括細(xì)胞程序性死亡受體-1(programmed cell death receptor 1，PD-1)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4(cytotoxic lymphocyte antigen 4，CTLA-4)。免疫檢查點作為免疫穩(wěn)態(tài)的重要組成部分，可下調(diào)機體免疫反應(yīng)應(yīng)答并參與外周耐受,而上調(diào)免疫檢查點信號通路可使得腫瘤細(xì)胞免受免疫細(xì)胞監(jiān)視[1]。因而免疫檢查點受體及其配體是理想的抗腫瘤治療靶點。但有研究發(fā)現(xiàn)通過阻斷PD-1治療肝癌患者，緩解率約為15%-20%[2-3]。

由于腫瘤細(xì)胞快速分裂增殖，血液供應(yīng)與活性代謝無法滿足要求，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境缺氧和酸中毒。低氧誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌促血管生成因子，從而打破了促血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡，血管生成途徑被激活，導(dǎo)致血管不成熟，且呈現(xiàn)迂回、滲漏的狀態(tài)，腫瘤灌注不良。但抗血管生成藥物會過度削減血管導(dǎo)致腫瘤組織缺氧加重，其中涉及到諸多相關(guān)蛋白或信號通路，而單一靶標(biāo)的藥物干預(yù)其靶點，往往會造成其他血管生成因子代償性現(xiàn)象，從而恢復(fù)腫瘤血管新生，這些都是導(dǎo)致抗血管生成藥物療效不佳的原因[4]。Yasuda等[5]發(fā)現(xiàn)ICI和抗血管生成藥物在治療小鼠結(jié)腸癌具有協(xié)同作用。隨后Wu等[6]證實ICI聯(lián)合抗血管生成藥物可以有效地延長乳腺癌小鼠的總生存期(overall survival，OS)。

本文對抗血管生成療法作用機制、腫瘤血管生成對ICI治療的影響以及ICI聯(lián)合抗血管生成藥物研究進展進行綜述。希望通過本文能夠加深對ICI聯(lián)合抗血管生成藥物治療腫瘤的認(rèn)識，并為后期的研究提供參考。

1 抗血管生成療法

實體瘤會分泌多種促血管生成因子，例如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)以及apelin等等，其中VEGF介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞過度增殖使其在血管生成中發(fā)揮著核心作用。VEGF主要與其受體VEGFR2 結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)功能。一方面，VEGF-VEGFR2通過激活下游PLCγ-PKC-Raf-MAPK和Grb2-Gab1-MAPK / PI3K-Akt信號通路來促進血管性血友病因子(von Wilebrand Factor，vWF)的表達(dá)和內(nèi)皮細(xì)胞的過度增殖和遷移[7]；另一方面，VEGF-VEGFR2可以通過激活VEGFR2-TSAD-SRC-cadherin和PI3K-AKT-eNOS-NO信號通路導(dǎo)致血管滲漏[8]。

1.1 抗血管生成：從抑制血管生成到腫瘤血管正?；Ｉ項l件下，功能性血管的形成需要經(jīng)歷內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接，基底膜形成和周細(xì)胞包被新生血管等過程[9]。但腫瘤微環(huán)境中VEGF的持續(xù)分泌，導(dǎo)致腫瘤血管結(jié)構(gòu)異常。Juda Folkman教授于1971年率先提出腫瘤生長和轉(zhuǎn)移都依賴于腫瘤的血管，認(rèn)為抑制腫瘤血管生成能夠作為抑制腫瘤生長和延長帶瘤生存期的治療法則，但抗血管生成藥物后期會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為缺氧可耐受表型，導(dǎo)致它的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力增加[10]。

抗血管生成藥物聯(lián)合其他療法顯著抑制腫瘤生長[11]。但使用抗血管生成藥物的同時，將會抑制藥物和氧氣的運輸。由此，Jain[12]建立了一個模型來描述抗血管生成藥物治療時腫瘤血管的瞬時狀態(tài)：血管正?；?。在該模型中，當(dāng)抗血管生成因子與促血管生成因子達(dá)到一定的平衡，異常結(jié)構(gòu)和功能的腫瘤血管會逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檎Ｑ艿谋硇?。Huang等[11]通過研究抗血管生成劑量與療效之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)使用高劑量(120或150 mg·kg-1)的VEGFR2抑制劑雖然能顯著抑制腫瘤血管生成，但會加速惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移，而在使用低劑量(10、20 mg·kg-1)或常規(guī)劑量(40 mg·kg-1)時，則具有抑制血管數(shù)量的作用，較低劑量的抗血管生成藥物在誘導(dǎo)腫瘤血管正?；矫鎯?yōu)于較高劑量的療效，血管正?；癄顟B(tài)取決于給藥時間和劑量。

此外，apelin是血管緊張素受體樣蛋白J(angotensin protein J，APJ)受體的內(nèi)源性配體，作為一種促血管生成肽，在多種腫瘤細(xì)胞以及腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中APLN/APLNR途徑均被上調(diào)，且其與腫瘤治療的不良預(yù)后相關(guān)[13]。Iris等[14]發(fā)現(xiàn)在肺癌和乳腺癌模型中，敲除apelin可以彌補抗血管生成療法因缺氧帶來的耐藥相關(guān)性問題。

1.2 血管正?；纳颇[瘤免疫微環(huán)境腫瘤血管正?；瘜τ谀[瘤微環(huán)境具有調(diào)節(jié)作用，能夠?qū)⒚庖咭种茽顟B(tài)重編程為免疫支持狀態(tài)。異常的腫瘤血管新生上調(diào)髓源抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)還有腫瘤細(xì)胞的PD-L1的表達(dá)水平，抑制效應(yīng)T細(xì)胞對腫瘤的浸潤并促進腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage，TAM)極化為免疫抑制性M2樣表型，形成低氧、酸性的腫瘤微環(huán)境。此外，缺氧還可以上調(diào)免疫抑制生長因子，例如轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β，TGFβ)。當(dāng)給藥時間和劑量都適宜時，抗血管生成療法能夠促進腫瘤血管正?；?，增加效應(yīng)T細(xì)胞的浸潤、減少Treg細(xì)胞以及MDSC募集，緩解的缺氧優(yōu)先誘導(dǎo)TAM極化為M1樣表型[15]。此外，低氧誘導(dǎo)的免疫抑制性信號如PD-L1通過血液灌注的改善也得以下調(diào)[16]。另外，抗VEGF藥物可阻斷DC分化的抑制信號并降低腫瘤微環(huán)境中MDSC數(shù)量[17]。

2 腫瘤血管生成對ICI治療的影響

2.1 腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的狀態(tài)決定ICI療效對于ICI治療，尤其是抗PD-1 / PD-L1抑制劑干預(yù)，腫瘤微環(huán)境中存在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)是有效治愈腫瘤的必要條件。根據(jù)已存在的TIL狀態(tài)，將腫瘤微環(huán)境分為3種類型：①免疫炎癥類型，功能性CD8+T細(xì)胞密集浸潤；②無浸潤類型，異常的血管生成和免疫抑制微環(huán)境阻止T細(xì)胞的浸潤；③免疫低下類型[18]。已經(jīng)證實，屬于免疫炎癥型的腫瘤比其他兩種類型的腫瘤對ICI治療更敏感[19]。因此，提高腫瘤組織T細(xì)胞浸潤程度能夠增強ICI療效。

2.2 血管生成促進免疫抑制微環(huán)境的形成在腫瘤免疫過程中，抗原呈遞決定特異性T淋巴細(xì)胞的生成。有特定T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)的T細(xì)胞浸潤到腫瘤，才能進行抗原識別并殺傷腫瘤。實體瘤內(nèi)的血管生成亢進通過多種途徑影響免疫抑制微環(huán)境的形成。VEGF和血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang-2)，可直接或間接作用內(nèi)皮細(xì)胞以及先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用。一方面，VEGF和Ang-2增強內(nèi)皮細(xì)胞中PD-1和PD-L1的表達(dá)，導(dǎo)致表達(dá)PD-1的細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能喪失。其次，VEGF下調(diào)腫瘤血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cellular adhesion molecule-1，VCAM-1)的表達(dá)，進而抑制T細(xì)胞穿越內(nèi)皮層滲入腫瘤。而且，由于Treg細(xì)胞中的FLICE抑制蛋白(cellular FLICE/caspase-8 inhibitory protein，CFLIP)高表達(dá)，腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，EC)Fas配體能夠選擇性觸發(fā)表達(dá)Fas的CD8+T細(xì)胞凋亡[15]。最后，EC還通過上調(diào)CLEVER-1 / stabilin-1募集免疫抑制性Treg細(xì)胞。所有這些途徑誘導(dǎo)有效屏障的形成，導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞不能浸潤腫瘤[15]。另一方面，VEGF通過免疫細(xì)胞中的VEGFR2信號進行傳導(dǎo)。首先，它可以上調(diào)樹突狀細(xì)胞PD-L1中的表達(dá)，并由于其抗原呈遞能力受損而抑制樹突狀細(xì)胞的成熟和功能。其次，VEGF / VEGFR2信號傳導(dǎo)抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖，增加并促進Treg的腫瘤歸巢，這種作用取決于neuropilin-1(nrp-1)。而且除了PD-1、CTLA-4外，VEGF還可以上調(diào)T細(xì)胞其它負(fù)性免疫檢查點受體，導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭。最后，高水平VEGF、Ang-2以及其他腫瘤分泌因子會促進TAM、MDSC和未成熟樹突狀細(xì)胞的募集和增殖。此外，這些免疫細(xì)胞群所分泌的細(xì)胞因子會促進腫瘤血管生成和免疫抑制微環(huán)境的形成[15]。

2.3 免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)血管生成一方面，免疫抑制細(xì)胞群如Treg、MDSC和M2型TAM，有助于腫瘤免疫逃逸，通過分泌基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1和胎盤生長因子(placental growth factor，PIGF)促進腫瘤血管生成。另一方面，TAM和MDSC通過表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)，以降解細(xì)胞外基質(zhì)去誘導(dǎo)腫瘤血管生成。Rolny等[20]發(fā)現(xiàn)富組氨酸糖蛋白(histidine-rich glycoprotein，HRG)通過抑制巨噬細(xì)胞FcγR受體，下調(diào)其衍生的PIGF，誘導(dǎo)M2樣TAM極化為M1樣表型，從而促進腫瘤血管正常化和減緩腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。此外，活化的CD11b+Gr1loF4/80+Siglec-F+嗜酸性粒細(xì)胞促進腫瘤血管正?；⒂兄贑D8+T細(xì)胞對腫瘤的殺傷作用。但其確切機制尚不明確，可能是通過嗜酸性粒細(xì)胞來源的干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)使得TAM極化為M1樣表型，導(dǎo)致VEGF的表達(dá)降低[21]。

此外，Huang等[22]發(fā)現(xiàn)單獨使用ICI通過激活效應(yīng)T細(xì)胞達(dá)到促進腫瘤血管正?；男Ч鸞22]。腫瘤血管正?；軠p輕腫瘤微環(huán)境免疫抑制的過程，促進效應(yīng)T細(xì)胞浸潤。免疫微環(huán)境重編程與腫瘤血管正?；g的這種正反饋調(diào)節(jié)相互加強，促進免疫介導(dǎo)的腫瘤根除[22]。

3 ICI聯(lián)合抗血管生成藥物的研究進展

活化的T細(xì)胞通過分泌IFN-γ作用于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上的IFN-γ受體上，直接促進使腫瘤血管正?；痆22]。基于腫瘤免疫與血管生成之間的相互作用，推測抗血管生成藥物可能增強ICI的療效。除了降低腫瘤微環(huán)境間質(zhì)壓并改善T細(xì)胞浸潤外，我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療也與其它機制相關(guān)。

3.1 阻斷VEGFR2誘導(dǎo)的免疫檢查點表達(dá)Dan等[23]進行肝癌小鼠模型研究。構(gòu)建原位移植或誘導(dǎo)HCC模型，分為6組(Ⅰ)IgG；(Ⅱ)抗PD-1 單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)：RMP-014；(Ⅲ)抗VEGFR2 mAb：DC101 10 mg·kg-1；(Ⅳ)抗VEGFR2 mAb：DC101 40 mg·kg-1；(Ⅴ)抗PD-1 mAb +抗VEGFR2 mAb：DC101 10 mg·kg-1；(Ⅵ)抗PD-1 mAb +抗VEGFR2 mAb：DC101 40 mg·kg-1。其中聯(lián)合治療組具有最佳療效。為了證實VEGFR2對免疫檢查點表達(dá)的影響，采用體外3-D培養(yǎng)，構(gòu)建異型腫瘤類器官。使用DC101后，類器官中腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中PD-L1表達(dá)明顯上調(diào)。隨后磁珠分選VEGFR2+細(xì)胞探究VEGFR2阻斷后PD-L1上調(diào)的具體機制，表明DC101靶向內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFR-2上調(diào)HCC細(xì)胞PD-L1這一過程，部分由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的IFN-γ所介導(dǎo)[23]。

此外，Voron等[24]觀察到抗VEGF可以選擇性抑制腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞免疫檢查點的表達(dá)。VEGF可以通過激活VEGFR2-PLCγ-calcineurin-NFAT信號通路來上調(diào)PD-1的表達(dá)。因此聯(lián)合療法能有效阻斷PD-1/PD-L1軸，抑制腫瘤生長，特別是VEGF分泌較高的腫瘤。

3.2 誘導(dǎo)高內(nèi)皮小靜脈形成Allen等[25]研究抗PD-L1 mAb：B20S和抗VEGFR2 mAb：DC101在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、乳腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的小鼠模型中聯(lián)合治療的療效。在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和乳癌中，聯(lián)合療法在腫瘤體積和總生存期方面比單一療法顯示出優(yōu)勢，對于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤而言，聯(lián)合療法優(yōu)勢更顯著。聯(lián)合治療2周后，僅50%膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中IFN-γ+CD8+T細(xì)胞略微增加，而胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和乳腺癌中IFN-γ+CD8+和IFN-γ+CD4+T細(xì)胞水平增加了兩倍。胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和乳腺癌中的血管除了完整的周細(xì)胞覆蓋之外，由肥大的內(nèi)皮細(xì)胞而不是扁平的內(nèi)皮細(xì)胞增厚，表現(xiàn)出高內(nèi)皮小靜脈(high endothelial venules，HEV)特征[26]。HEV與淋巴細(xì)胞歸巢有關(guān)，淋巴毒素β受體(lymphotoxin beta receptor，LTβR)信號通路對維持HEV表型至關(guān)重要，聯(lián)合治療通過激活LTβR信號通路有效殺死膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞。

3.3 抑制IFN-γ介導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)Schmittnaegel等[27]發(fā)現(xiàn)雙特異性抗體A2V同時靶向VEGF和ANG2的阻斷要比單一療法有更好的治療效果，且聯(lián)合抗PD-1治療能進一步增強雙重阻斷的療效。在這項臨床前研究中，采用多種荷瘤小鼠模型，包括轉(zhuǎn)基因或移植性乳腺癌、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌、黑色素瘤和結(jié)直腸癌模型。A2V處理后，腫瘤微環(huán)境中多種抗腫瘤免疫細(xì)胞數(shù)量增加，如成熟DC、M1樣表型TAM、IFN-γ+/ CD69+CD8+T細(xì)胞等，但由于IFN-γ所介導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制，致使腫瘤血管周圍的CD8+T細(xì)胞增加且腫瘤細(xì)胞PD-L1的高表達(dá)。而抗PD-1和A2V的聯(lián)合治療能夠抑制IFN-γ介導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)并增強免疫反應(yīng)，與A2V療法相比，接受聯(lián)合治療的超過30%的小鼠OS延長。

3.4 ICI聯(lián)合抗血管生成藥物的臨床研究

3.4.1抗CTLA -4 mAb聯(lián)合抗VEGF mAb NCT00790010是一項I期臨床試驗[28]，旨在探討易普利姆瑪(抗CTLA-4 mAb)和貝伐單抗(抗VEGF mAb)在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中的作用。所有46名入選患者均被分為4組，并接受了不同劑量的聯(lián)合治療。該治療方案顯著上調(diào)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的CD31、E-選擇素、VCAM-1和其他粘附分子的表達(dá)，增加細(xì)胞毒性T細(xì)胞和成熟DC浸潤。與之前的研究結(jié)果相比，接受聯(lián)合治療的患者在預(yù)后方面占有很大優(yōu)勢。

進一步的研究表明，聯(lián)合治療的有利優(yōu)勢可能源于誘導(dǎo)galectin-1(Gal-1)的免疫反應(yīng)[28]。Gal-1參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、免疫逃逸和血管生成等過程。收集患者的血漿樣品以檢測抗Gal-1抗體的濃度，結(jié)果表明，聯(lián)合治療后62.5%完全緩解/部分緩解患者中抗Gal-1抗體滴度增加≥1.5倍，36.4%病情穩(wěn)定患者和23.1%病情惡化患者治療后抗Gal-1抗體滴度略微增加。對聯(lián)合療法的不同反應(yīng)歸因于不同的抗Gal-1免疫反應(yīng)。一方面，抗VEGF mAb上調(diào)Gal-1的表達(dá)，另一方面，抗CTLA-4 mAb增加T細(xì)胞克隆的表型。這兩個因素提高了抗原呈遞細(xì)胞識別Gal-1的可能性。此外，另外兩項臨床試驗(NCT02210117和NCT01950390)正在研究易普利姆瑪聯(lián)合貝伐單抗分別治療轉(zhuǎn)移性腎癌和III-IV期黑色素瘤患者的療效。

3.4.2抗PD- L1 mAb聯(lián)合抗VEGF mAb Wallin等[29]受到抗CTLA-4 mAb和抗VEGF mAb聯(lián)合治療作用顯著的啟發(fā)，開展抗PD-L1 mAb聯(lián)合抗VEGF mAb的臨床研究。NCT01633970是一項旨在研究阿特珠單抗(抗PD-L1)聯(lián)合貝伐單抗或化療的安全性和藥理學(xué)作用的1b期臨床實驗。

10名腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移性患者接受1周期的貝伐單抗單藥治療后，實施聯(lián)合治療方案，直至疾病向不良方向發(fā)展。結(jié)果10名患者中有8名患者病情得以控制。此外，與貝伐單抗單藥治療后患者的腫瘤樣品相比，聯(lián)合治療后CD8、PD-L1以及主要組織相容性復(fù)合物-I的表達(dá)顯著增加[29]。

3.4.3抗PD-L1 mAb聯(lián)合抗血管生成藥物TKI 到目前為止，臨床研究中的聯(lián)合方案多由ICI和抗血管生成藥物貝伐單抗組成。2018年，Choueiri等[30]首先報道了阿維魯單抗(抗PD-L1 mAb)聯(lián)合阿昔替尼(TKI)在晚期腎透明細(xì)胞癌(JAVELIN Renal 100)中的臨床實驗(NCT02493751)。55名患者中，除一名患者由于磷酸肌酸激酶異常增加，其余54名患者都接受阿維魯單抗聯(lián)合阿昔替尼治療。在近一年的隨訪期內(nèi)，58%的患者對聯(lián)合治療表現(xiàn)出完全緩解或部分緩解，20%的患者病情相對穩(wěn)定。此外，發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)沒有顯著影響治療效果[30]，見Tab 1。

Tab 1 Clinical trials investigating efficacy of ICI plus anti-angiogenesis therapy

4 總結(jié)與展望

免疫檢查點抑制劑和抗血管生成藥物單獨使用均有各自的局限性，而臨床前和臨床研究表明抗血管生成藥物聯(lián)合ICI治療腫瘤的作用相互增強。一方面，抗血管生成劑通過增加抗/促腫瘤免疫細(xì)胞的比例和降低多個免疫檢查點的表達(dá)抑制負(fù)性免疫應(yīng)答；另一方面，ICI治療可以重塑免疫微環(huán)境并促進血管正常化。此外，血管正?；軌蛱岣咚幬镞f送效率，使得較小劑量的ICI就能發(fā)揮較大治療效果，避免大劑量ICI帶來的不良反應(yīng)。但目前需要解決的主要問題是如何在聯(lián)合治療中優(yōu)化抗血管生成劑的給藥時間和劑量，擴大血管正?；翱诓@得最長的生存期?？傊?，ICI聯(lián)合抗血管生成藥物將是克服治療耐藥性并改善患者預(yù)后的有效策略。