火麻仁蛋白的提取分離及理化性質(zhì)研究

徐鵬偉，劉家寧，常森林，王曉東，常坦然，于朝暉，趙慶生*，趙兵*

（1.中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.云南漢盟制藥股份有限公司，云南 昆明 650000）

大麻（Cannabis sativa L.）廣泛種植于亞洲、歐洲及南美等地，由于大麻中的四氫大麻酚具有致幻成癮的特性，因此許多國(guó)家將其列為毒品而被禁止種植，但是不同大麻品種中的四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）含量差別很大，THC含量低于0.3%的品種被列為工業(yè)大麻[1]。工業(yè)大麻，又稱火麻，在我國(guó)大量種植?；鹇榈姆N子仁富含不飽和脂肪酸、微量元素和蛋白質(zhì)，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的農(nóng)作物[2-5]。

火麻仁蛋白（hemp seed protein isolate，HPI）因易于消化而聞名，體外模擬人體胃腸道消化表明，火麻仁蛋白易于被胃蛋白酶和胰蛋白酶消化，其消化率高達(dá)88%～91%[6-8]。火麻仁蛋白由兩種蛋白（火麻仁球蛋白和麻仁白蛋白）組成[9]，包含所有人體所需氨基酸，且精氨酸含量豐富[10]，研究證明，火麻仁蛋白粉可以改善運(yùn)動(dòng)員的耐力和增強(qiáng)力量[11]?；鹇槿实鞍撞粌H營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，且沒有致敏因子[7]?；鹇槿实鞍鬃鳛橹参锏鞍椎膩碓?，具有很高的開發(fā)潛力[12]。

常見的植物蛋白通常是通過堿提/酸沉法制備[13-15]。文獻(xiàn)報(bào)道，氯化鈉溶液可用于提取分離植物球蛋白[16-17]，對(duì)于火麻仁蛋白而言，球蛋白含量高于70%[18]，是主要的儲(chǔ)藏蛋白，與人體免疫功能有關(guān)，因此利用氯化鈉溶液提取分離火麻仁蛋白也是開發(fā)利用火麻仁蛋白的一個(gè)重要途徑。Hadnadev等[16]報(bào)道，通過氯化鈉溶液溶解火麻仁蛋白，然后通過透析袋脫鹽，將蛋白質(zhì)沉淀下來，試驗(yàn)的局限性在于提取量小且試驗(yàn)操作復(fù)雜，因此，仍需要在此基礎(chǔ)上，深入研究氯化鈉溶液的提取溫度對(duì)火麻仁蛋白溶解性的影響。

本研究旨在確定兩種分離方法對(duì)于制備得到的火麻仁蛋白理化性質(zhì)、功能特性以及微觀結(jié)構(gòu)的影響，從多方面評(píng)價(jià)分離方法，為火麻仁蛋白產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火麻仁：云南漢盟制藥股份有限公司。

氫氧化鈉、鹽酸、亞硫酸鈉：北京化工廠；石油醚、三（羥甲基）氨基甲烷 [tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、甘氨酸（glycine，Gly）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、尿素（urea）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）[5，5′-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]、異硫氰酸苯酯、二硫蘇糖醇（dithio threitol，DTT）：阿拉丁試劑公司；氯化鈉、結(jié)晶乙酸鈉：天津市福晨化學(xué)試劑廠；蛋白質(zhì)凝膠電脈（sodium dodecyl sulfate polyacylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KDN-520凱氏定氮儀：徐州華納精密儀器有限公司；WF2UV-2802H分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；F-4600熒光分光光度計(jì)：日立高新技術(shù)公司；LC-20AT液相色譜：島津公司。

1.3 溶液配制

緩沖溶液A：0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、0.004 mol/L EDTA（Tris-Gly，pH 8.0）、8 mol/L 尿素。

緩沖溶液B：0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、0.004 mol/L EDTA、8 mol/L尿素和0.1 mol/L Na2SO3（pH 9.5）。

2-硝基-5-硫代磺基苯甲酸酯（2-nitro-5-thiosulfobenzoate，NTSB）儲(chǔ)備溶液：將 0.1 g DTNB 溶解于10 mL 1 mol/L Na2SO3中，pH值調(diào)至7.5。將氧氣連續(xù)引入離心管中，水浴條件下維持溫度37℃，直到溶液顏色從紅色變?yōu)闇\黃色為止，證明了NTSB的生成。

NTSB 測(cè)試溶液：用緩沖溶液 B 25℃（100∶1，體積比）稀釋NTSB儲(chǔ)備溶液，制備NTSB測(cè)試溶液。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 脫脂火麻仁粉（defatted hemp seed meal，HPM）的制備

通過機(jī)械壓榨（脫殼）火麻仁以脫除油脂，然后將脫除油脂的火麻仁粉和正己烷[（1∶20（g/mL）]混合，25℃下充分?jǐn)嚢杳摮Ｓ嘤椭?，得到脫脂火麻仁粉（HPM）。

1.4.2 堿提/酸沉法制備火麻仁堿提蛋白（hemp seed protein isolate-alkaline extraction，HPI-AE）

將HPM分散在去離子水[料液比1∶20（g/mL）]中，pH值調(diào)至9.5，50℃下充分?jǐn)嚢?，離心收集上清液。將上清液pH值調(diào)至5.0，使蛋白質(zhì)充分沉淀，離心獲得沉淀物。將沉淀物分散在去離子水中，將pH值調(diào)至7.0，然后冷凍干燥獲得HPI-AE。

1.4.3 鹽溶/鹽析法制備火麻仁鹽提蛋白 （hemp seed protein isolate-salt extraction，HPI-SE）

將HPM分散在5%NaCl溶液 [料液比1∶15（g/mL）]中，50℃條件下充分?jǐn)嚢? h。趁熱離心獲得上清液。將上清液在4℃下保存24 h，然后離心獲得沉淀物。將沉淀物分散在去離子水中，洗滌后經(jīng)離心以便脫除氯化鈉。然后將沉淀物冷凍干燥獲得HPI-SE。

1.4.4 理化性質(zhì)

1.4.4.1 蛋白含量的測(cè)定及蛋白回收率計(jì)算

采用凱氏定氮法確定樣品蛋白含量。將蛋白樣品與濃硫酸和催化劑硫酸鉀一同置于消化爐加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解后的氨和硫酸結(jié)合生成硫酸銨，然后堿化蒸餾使氨游離出來，用硼酸吸收后再以鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)鹽酸的消耗量乘以換算系數(shù)，換算成蛋白質(zhì)含量。

蛋白含量計(jì)算公式如下。

式中：X為蛋白含量，%；ΔV為試樣消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；C為鹽酸濃度，mol/L；0.014為1.0 mL鹽酸（1.0 mol/L）標(biāo)準(zhǔn)滴定液相當(dāng)于氮元素的質(zhì)量，g；M為試樣質(zhì)量，g；F為換算系數(shù)，本研究選擇系數(shù)F=5.9。

回收率計(jì)算公式如下。

式中：R為蛋白回收率，%；MHPI為提取分離獲得的 HPI的質(zhì)量，g；XHPI為 HPI中蛋白含量，%；MHPM為用于提取分離蛋白的HPM的質(zhì)量，g；XHPM為HPM中蛋白含量，%。

1.4.4.2 外觀色澤

HPI的顏色測(cè)量通過將蛋白質(zhì)溶解于1 mol/L氫氧化鈉溶液中，配制成20 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，在420、520、620 nm條件下測(cè)吸光值。經(jīng)過公式計(jì)算確定了參數(shù) L*（亮度），a*（紅-綠色）和 b*（黃-藍(lán)色）的值。計(jì)算公式如下。

式中：A 為吸光值；τ 為透光率；X0為 97.285；Y0為100；Z0為 116.145。

1.4.4.3 巰基（SH）和二硫鍵（S-S）含量

巰基可分為總巰基（SHT）、游離巰基（SHF）。

SHT的測(cè)定方法：將火麻仁蛋白溶解于緩沖溶液A中（5 mg/mL），充分混合后離心10 min，收集上清液，梯度稀釋獲得不同濃度的火麻仁蛋白溶液；將80 μL Ellman試劑（4 mg/mL DNTB）添加到火麻仁蛋白溶液（2 mL）中，充分混合5 min后，在412 nm處測(cè)量吸光度。

SHF的測(cè)定方法：將火麻仁蛋白溶解到緩沖溶液B（5 mg/mL）中，充分混合10 min后離心，收集上清液。用NTSB測(cè)試溶液線性稀釋火麻仁蛋白溶液以獲得不同濃度的蛋白質(zhì)溶液，412 nm處測(cè)量吸光度。

巰基含量計(jì)算公式如下。

二硫鍵含量計(jì)算公式如下。

式中：CSH為 SH 含量，μmol/g；CS-S為 S-S含量，μmol/g；A412為412 nm處的吸光度；C為樣品濃度，mg/mL；D為稀釋系數(shù)；73.53為106（/1.36×104），其中1.36×104為摩爾吸收率，106為轉(zhuǎn)化因子。

1.4.4.4 SDS-PAGE

非還原狀態(tài)下的蛋白質(zhì)電泳分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。方法如下，將樣品（2 mg/mL）分散于不含二硫蘇糖醇非還原性緩沖液中，95℃條件下加熱15 min后冷卻，電泳時(shí)蛋白上樣10 μL。

還原狀態(tài)下的蛋白質(zhì)電泳分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為5%。方法如下，將樣品（2 mg/mL）分散于含DTT的還原性緩沖液中，95℃條件下加熱15 min后冷卻，電泳時(shí)蛋白上樣10 μL。

凝膠采用考馬斯亮藍(lán)染色，最后用脫色液脫色至背景無色。

1.4.4.5 氨基酸組成

氨基酸通過柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定[19]。適量樣品置于密封管中，用16 mL 6 mol/L鹽酸預(yù)處理，110℃條件下消化24 h，蛋白質(zhì)完全水解，獲得氨基酸溶液。使用異硫氰酸苯酯對(duì)氨基酸衍生化，液相檢測(cè)。

酸性條件下水解蛋白質(zhì)會(huì)導(dǎo)致色氨酸被破壞，因此蛋白質(zhì)需要在堿性條件下水解[20]。110℃下堿性環(huán)境水解24 h，獲得色氨酸溶液，無需柱前衍生，直接液相檢測(cè)。氨基酸含量計(jì)算公式如下。

式中：C為氨基酸含量，%；M為單一氨基酸質(zhì)量，mg；M總為所有氨基酸質(zhì)量之和，mg。

1.4.5 火麻仁蛋白功能性

1.4.5.1 溶解性

依據(jù)文獻(xiàn)[21]報(bào)道，不同pH值條件下，火麻仁蛋白的溶解性（protein solubility，PS）測(cè)定方法如下：將蛋白樣品（0.1 g）溶解在10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中，測(cè)定的蛋白含量作為樣品蛋白的總含量 （對(duì)照）；將10 mg/mL火麻仁蛋白樣品pH值分別調(diào)節(jié)為3.0～11.0，充分?jǐn)嚢? h，8 000 g條件下離心30 min得上清液。使用Bradford方法分析上清液中的蛋白含量。蛋白質(zhì)溶解度計(jì)算公式如下。

式中：PS為蛋白質(zhì)溶解度，%；M上清為上清液中蛋白的質(zhì)量，g；M總為總的蛋白質(zhì)質(zhì)量，g。

1.4.5.2 起泡性/泡沫穩(wěn)定性

火麻仁蛋白在不同pH值條件下的起泡性（foaming capacity，F(xiàn)C）和泡沫穩(wěn)定性（foaming stability，F(xiàn)S）測(cè)定方法如下，將10 mg/mL蛋白樣品pH值分別調(diào)為3.0～11.0。高速乳化機(jī)快速剪切攪拌10 min，使蛋白溶液充分起泡，記錄溶液體積和初始泡沫體積。FC計(jì)

算公式如下。

式中：FC為蛋白質(zhì)起泡性，%；V初為泡沫的初始體積，mL；V液為溶液體積，mL。

泡沫靜置30 min，記錄穩(wěn)定泡沫體積。泡沫穩(wěn)定性計(jì)算公式如下。

式中：FS為泡沫穩(wěn)定性，%；V穩(wěn)為穩(wěn)定泡沫體積，mL；V初為初始泡沫體積，mL。

1.4.6 熒光光譜

蛋白質(zhì)分子中含有的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）3種芳香族氨基酸殘基，在紫外光的照射下會(huì)發(fā)射熒光。在固定激發(fā)波長(zhǎng)的照射下，熒光光譜利用蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的熒光波長(zhǎng)隨外界環(huán)境變化而改變的特點(diǎn)，用于研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。在0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4）中制備蛋白質(zhì)儲(chǔ)備溶液（10 mg/mL），然后將pH值調(diào)節(jié)至3.0、5.0、7.0、9.0和11.0。用緩沖液將儲(chǔ)備溶液稀釋至0.01%，在熒光分光光度計(jì)上記錄熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)：275 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：290nm～450nm。

2 結(jié)果和分析

2.1 理化性質(zhì)

2.1.1 理化參數(shù)

HPI的理化參數(shù)如表1所示。

從表1中可以看出蛋白質(zhì)是HPM的主要成分；HPI-SE的蛋白含量（94.8%）高于HPI-AE的蛋白含量（85.9%）。氯化鈉溶液常用于提取植物球蛋白，并且火麻仁蛋白中球蛋白含量較高[16]，通過氯化鈉提取火麻仁蛋白具有廣闊前景；鹽溶/鹽析過程中，溶液溫度的改變對(duì)于火麻仁球蛋白的溶解性影響較大，其它物質(zhì)的溶解性沒有明顯變化，因而鹽溶/鹽析法更利于提取火麻仁球蛋白，因此HPI-SE的蛋白含量更高。HPIAE的蛋白回收率為83.43%，高于HPI-SE蛋白回收率59.06%。對(duì)于堿提/酸沉法而言，堿提蛋白時(shí)，蛋白質(zhì)分子攜帶大量的同種電荷阻礙了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀，從而提高了蛋白質(zhì)的溶解性；等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間靜電斥力消失，蛋白質(zhì)分子聚集沉淀。等電點(diǎn)沉淀過程中，大部分蛋白沉淀下來的同時(shí)，也有部分其它物質(zhì)沉淀下來，從而導(dǎo)致HPIAE中蛋白回收率較高，蛋白含量較HPI-SE低。

表1 理化參數(shù)Table 1 Physicochemical properties

由表1可知，HPI-SE具有高的L*值、較低的a*值和b*值；說明了HPI-SE的外觀色澤比HPI-AE的外觀色澤更亮白。堿提/酸沉法提取火麻仁過程中，羰基化合物（還原糖類）和氨基化合物（蛋白質(zhì)）間的美拉德反應(yīng)生成棕色的大分子類物質(zhì)，等電點(diǎn)沉淀過程中，這些物質(zhì)也沉淀下來，從而導(dǎo)致HPI-AE外觀呈現(xiàn)淺黃色。

游離巰基、總巰基和二硫鍵含量測(cè)試結(jié)果顯示，HPI-SE中游離巰基、總巰基和二硫鍵的含量分別為26.49、59.10、16.33 μmol/g；含量均略高于 HPI-AE，后者游離巰基、總巰基和二硫鍵的含量分別為22.44、50.77、14.17 μmol/g。巰基和二硫鍵是蛋白質(zhì)構(gòu)象中的重要官能團(tuán)，二硫鍵可以保持折疊構(gòu)象的穩(wěn)定性并降低構(gòu)象熵，從而提高熱穩(wěn)定性[22]；分子間二硫鍵的形成，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子更易聚集沉淀。火麻仁蛋白中游離巰基的含量高于木瓜種子蛋白中游離巰基的含量9.73 μmol/g[23]，也高于三葉木通蛋白中游離巰基的含量10.82 μmol/g[24]，因此巰基含量高可能是導(dǎo)致火麻仁蛋白溶解性差的原因之一。

2.1.2 蛋白質(zhì)電泳

HPM和HPI在非還原狀態(tài)和還原狀態(tài)條件下的蛋白質(zhì)電泳見圖1。

圖1 HPI-AE、HPI-SE和HPM在非還原狀態(tài)和還原狀態(tài)條件下的蛋白質(zhì)電泳Fig.1 SDS-PAGE of HPI-AE，HPI-SE and HPM under non-reducing and reducing conditions

如圖1所示，非還原狀態(tài)下HPM和HPI的主要肽鏈分子量均為55 kDa；還原狀態(tài)下HPM和HPI主要肽鏈分子量均為34、19、18 kDa。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPM和HPI具有相同的蛋白組成，成分均是火麻仁球蛋白。本研究中，火麻仁球蛋白由6個(gè)分子量為55 kDa的亞基組成，每個(gè)亞基由一個(gè)酸性基團(tuán)和一個(gè)堿性基團(tuán)通過二硫鍵連接組成；還原狀態(tài)下，亞基的二硫鍵被打開，形成一個(gè)分子量為34 kDa的酸性基團(tuán)和分子量為19 kDa或18 kDa堿性基團(tuán)。其中酸性基團(tuán)由單一肽鏈構(gòu)成，分子量為34 kDa；堿性基團(tuán)有兩種肽鏈形式，分子量分別為 19、18 kDa。

在非還原狀態(tài)下，有少量分子量為35、19、18 kDa的肽鏈，表明在非還原狀態(tài)下，依然有少量亞基的二硫鍵被打開。非還原狀態(tài)下，HPI中出現(xiàn)了少量分子量大于100 kDa的條帶，但未在HPM中出現(xiàn)。表明了在提取分離蛋白過程，由于溫度等一些外在因素導(dǎo)致了部分蛋白質(zhì)變性，從而交聯(lián)形成了聚合物。

2.1.3 氨基酸組成

HPM和HPI的氨基酸組成見表2。

由表2所示，HPI和HPM的氨基酸組成相近，意味著兩種分離過程只是富集了火麻仁蛋白質(zhì)，未引起蛋白質(zhì)組成太大變化。和其它植物蛋白相比[10]，火麻仁蛋白中含有豐富的精氨酸，尤其HPI-SE精氨酸含量高達(dá)15.09%；已有研究表明，飲食中精氨酸/賴氨酸的比值越高，降低膽固醇的作用越明顯，有利于心血管健康[25]，HPI-SE的精氨酸/賴氨酸的值高達(dá)5.72，與HPIAE相比，HPI-SE可能對(duì)改善心血管健康有更好的積極作用。支鏈氨基酸能夠直接為肌肉提供能量，在運(yùn)動(dòng)過程中被直接消耗供能，減少肌肉的過度分解，起到保護(hù)肌肉的作用[9]，火麻仁蛋白的必需氨基酸（EAA）含量均高于30%，支鏈氨基酸含量均高于16%，以上結(jié)果表明，火麻仁蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白。

表2 HPM和HPI的氨基酸組成Table 2 The amino acid composition of HPM and HPI

2.2 火麻仁蛋白功能性

2.2.1 蛋白質(zhì)溶解

不同pH值條件下HPI的溶解性見圖2。

圖2 不同pH值條件下火麻仁蛋白的溶解性Fig.2 Protein solubility of HPI at different pH

蛋白溶解性是蛋白其它功能特性的基礎(chǔ)，影響蛋白在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，因此探究火麻仁蛋白的溶解曲線是進(jìn)一步研究蛋白其它功能特性的基礎(chǔ)。由圖2可知，在pH3.0～11.0的范圍內(nèi)，HPI的溶解性呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，均呈U型。但是HPI具有相異的等電點(diǎn)；HPI-AE在pH 6.0時(shí)溶解度最小，為1.34%；而HPISE在pH 7.0時(shí)溶解度最小，為0.65%。當(dāng)pH值接近等電點(diǎn)時(shí)，靜電斥力的喪失有助于蛋白質(zhì)聚集體的形成，從而導(dǎo)致火麻仁蛋白的溶解性降低[26]；當(dāng)pH值遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，火麻仁蛋白攜帶相同電荷，由于靜電斥力的作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集程度下降，從而蛋白質(zhì)的溶解性提高。與HPI-AE相比，HPI-SE在pH＜5的條件下溶解度更高，相反地，當(dāng)pH＞9.0時(shí)，HPI-AE的溶解度略高于HPI-SE。

2.2.2 起泡性/泡沫穩(wěn)定性

不同pH值條件下HPI的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性見圖3。

圖3 HPI在不同pH值條件下的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性Fig.3 Foaming capacity and foaming stability of HPI at different pH

蛋白的起泡性在蛋白質(zhì)某些產(chǎn)品開發(fā)過程中極為關(guān)鍵，例如蛋糕制作過程中，蛋白的起泡性能直接決定產(chǎn)品的成敗，因而有必要研究火麻仁蛋白的起泡性。比較圖3和圖2得知在不同的pH值條件下，蛋白質(zhì)的起泡性/泡沫穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)溶解性呈正相關(guān)。其中HPI-AE和HPI-SE均在溶液pH 1.0時(shí)起泡能力最強(qiáng)，分別為113.33%和103.35%；在等電點(diǎn)附近，HPI的起泡能力和穩(wěn)定均最差。當(dāng)pH值遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的起泡性/泡沫穩(wěn)定性迅速增加，說明蛋白良好的溶解性是獲得較好起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的前提。蛋白質(zhì)的起泡過程意味著蛋白質(zhì)被吸附在空氣-水界面上，并通過分子間相互作用重新排列形成彈性薄膜[27]；火麻仁蛋白是生物大分子，具有天然的疏水性；溶解性改善后的火麻仁蛋白親水性增強(qiáng)；此時(shí)蛋白質(zhì)分子更易吸附在空氣-水界面上，這有助于泡沫的形成，并使泡沫穩(wěn)定性增強(qiáng)。

2.3 熒光光譜

不同pH值條件下HPI的熒光光譜見圖4。

溶液的pH值決定著HPI的溶解性和起泡性，但是在不同pH值條件下，蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)是否因此而改變值得探討。在不同pH值條件下，熒光光譜通過探究芳香族氨基酸殘基的微觀環(huán)境是否改變，可以部分解釋溶液pH值對(duì)于火麻仁蛋白結(jié)構(gòu)的影響。由圖4可知，試驗(yàn)過程未觀察到300 nm～310 nm處的酪氨酸的發(fā)射光譜，這可能是由于強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用導(dǎo)致酪氨酸-色氨酸能量轉(zhuǎn)移增加，進(jìn)而導(dǎo)致酪氨酸的發(fā)射光譜被色氨酸的發(fā)射光譜覆蓋[17，28]。HPI的最大發(fā)射波長(zhǎng)（λmax）均小于335 nm，這表明在不同pH值條件下，色氨酸殘基均位于疏水性較強(qiáng)的內(nèi)部，蛋白質(zhì)保持一個(gè)較為致密的結(jié)構(gòu)?；鹇槿实鞍椎淖畲蟀l(fā)射波長(zhǎng)（λmax）隨著溶液酸性/堿性增強(qiáng)而略有紅移，意味著部分色氨酸殘基從疏水性強(qiáng)的內(nèi)部向親水性強(qiáng)的表面轉(zhuǎn)移，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸變得松散，原因是當(dāng)pH值逐漸遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，靜電斥力的加強(qiáng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集程度降低，部分色氨酸暴露在蛋白質(zhì)分子表面。

圖4 不同pH值條件下HPI-AE和HPI-SE的熒光光譜Fig.4 Fluorescence emission spectrum of HPI-AE and HPI-SE at different pH values

在pH值逐漸接近等電點(diǎn)的過程中，熒光強(qiáng)度加強(qiáng)預(yù)示著色氨酸-色氨酸相互作用加強(qiáng)，表明了蛋白質(zhì)聚集程度加強(qiáng)；當(dāng)pH值接近等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的聚集程度達(dá)到最大，火麻仁蛋白的溶解度最低，進(jìn)而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。在相同pH值條件下，HPI-SE的熒光強(qiáng)度高于HPI-AE的熒光強(qiáng)度，說明HPI-SE的色氨酸-色氨酸相互作用較HPI-AE更強(qiáng)，預(yù)示著它的蛋白質(zhì)聚集程度較大。

3 結(jié)論

兩種分離方法對(duì)火麻仁蛋白的氨基酸組成影響較小，二者氨基酸組成相似且均含有豐富的精氨酸；SDS-PAGE表明二者蛋白質(zhì)組成均主要為火麻仁球蛋白。堿提/酸沉法得到的HPI-AE蛋白回收率高，但蛋白含量低，外觀呈淡黃色；相反，鹽溶/鹽析法得到的HPI-SE蛋白回收率低，但蛋白含量高，外觀呈亮白色。因而HPI-SE更適合摻入到高蛋白含量的食物中。研究證明蛋白質(zhì)分離過程會(huì)影響火麻仁蛋白的功能性，二者雖具有相似的溶解性曲線，但是在相同pH值條件下，二者的溶解性存在較大的差異。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的起泡性/泡沫穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)溶解性呈正相關(guān)，證實(shí)了良好的溶解性是蛋白質(zhì)增強(qiáng)起泡性的前提。