HPLC 法測(cè)定人血漿中奧卡西平活性代謝產(chǎn)物單羥基卡馬西平的濃度

姚囡囡，周 宇，付文倩，黃 珊，宋洪濤 （中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院藥學(xué)科，福建 福州 350025）

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；H1850R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；DHG-9145A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海恒科儀器有限公司）；SHBB95A 型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；Discovery DV215CD 型分析天平（美國(guó)OHAUS 公司）；Vortex-5 型渦旋混合器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 材料

MHD 對(duì)照品（美國(guó)CATO 公司）；內(nèi)標(biāo)：奧硝唑（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈（色譜純，上?？曝S化學(xué)試劑有限公司）；空白血漿（醫(yī)院血庫(kù)提供）；超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），預(yù)柱為Eclipse XDB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水-乙腈（80:20，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μl；雙波長(zhǎng)檢測(cè)：在192 nm 處檢測(cè)MHD，318 nm 處檢測(cè)奧硝唑。

2.2 溶液及血漿樣品的配制

2.2.1 儲(chǔ)備液的配制

精密稱取MHD 對(duì)照品10 mg 于10 ml 的量瓶中，用甲醇溶解配制成濃度為1 mg/ml 的儲(chǔ)備液，置于-20 ℃下保存。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)工作液的配制

精密稱取奧硝唑1.4 mg 于10 ml 的量瓶中，用甲醇溶解配制成濃度為140 μg/ml 的內(nèi)標(biāo)工作液，置于-20 ℃下保存。

2.2.3 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的配制

多風(fēng)電場(chǎng)無功優(yōu)化問題,即包括海上風(fēng)電場(chǎng)在內(nèi)的各個(gè)風(fēng)電場(chǎng)利用風(fēng)機(jī)自身無功調(diào)節(jié)能力及無功補(bǔ)償設(shè)備,如高壓并聯(lián)電抗器(以下簡(jiǎn)稱“高抗”),實(shí)現(xiàn)對(duì)區(qū)域電網(wǎng)內(nèi)無功功率的優(yōu)化調(diào)節(jié),從而達(dá)到提高區(qū)域電網(wǎng)節(jié)點(diǎn)電壓質(zhì)量和減少網(wǎng)絡(luò)損耗的目的。崇明島、北支廠址兩個(gè)海上風(fēng)電場(chǎng)所采用的無功補(bǔ)償方式為固定高抗和可投切高抗聯(lián)合補(bǔ)償?shù)姆绞?能夠靈活調(diào)節(jié)輸出無功功率[9]。

分別精密量取適量?jī)?chǔ)備液，用甲醇稀釋成20、50、100、200、300、400、500 μg/ml 濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液。取以上6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液，加入適量空白血漿，得2、5、10、20、30、40、50 μg/ml 系列濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。同法配制相應(yīng)的低、中、高濃度的血漿質(zhì)控樣品（QC），使得MHD 對(duì)應(yīng)的濃度分別為5、15、40 μg/ml。

2.3 血漿樣品的預(yù)處理

取200 μl 血漿樣品，加入200 μl 內(nèi)標(biāo)工作液、400 μl 甲醇，渦旋混合30 s，10 ℃條件下13 000 r/min離心10 min，取上清液直接進(jìn)樣。

3 結(jié)果

3.1 專屬性試驗(yàn)

通過考察6 份不同生物來源的空白血漿樣品色譜圖、空白血漿樣品加入MHD 對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)的色譜圖，以及臨床實(shí)際用藥后的患者血漿樣品色譜圖，以此反映方法的專屬性。由圖1 可見，在本實(shí)驗(yàn)條件下，被測(cè)物MHD 與內(nèi)標(biāo)的色譜峰分離良好，且血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。MHD 和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為9.5 min 和6.1 min。

圖1 奧卡西平代謝產(chǎn)物單羥基卡馬西平的HPLC 圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

取上述濃度為2、5、10、20、30、40、50 μg/ml的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品按“2.3”項(xiàng)下方法處理。經(jīng)HPLC 法分析，以測(cè)得OXC 的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）作為縱坐標(biāo)，以血漿MHD 濃度（X）為橫坐標(biāo)，得到回歸方程為：Y=0.047 1X+0.022 2（r=0.998 6）。線性范圍：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，MHD 血藥濃度在2～50 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其定量下限濃度為2 μg/ml。

3.3 日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度

配制定量下限、低、中、高（2、5、15、40 μg/ml）4 種濃度的QC 樣品各6 個(gè)，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后測(cè)定，連續(xù)測(cè)定3 d，以當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC 樣品的測(cè)定濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度以及準(zhǔn)確度。經(jīng)測(cè)定，MHD 的日內(nèi)、日間精密度RSD均小于15%，準(zhǔn)確度在95.57%～100.59%之間，均符合生物樣品的測(cè)定要求，結(jié)果見表1。

表1 單羥基卡馬西平日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度（n=6）

3.4 提取回收率

配制低、中、高（5、15、40 μg/ml）3 種濃度的QC 樣品各6 個(gè)，按“2.3”項(xiàng)下方法處理。同時(shí)另取18 份空白血漿，除了不加系列對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)外，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，在獲得的上清液中加入MHD 和內(nèi)標(biāo)溶液至相應(yīng)濃度。進(jìn)樣分析，以每一濃度中2 種不同處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率。經(jīng)測(cè)定，本法中MHD 的平均提取回收率在89.62%～95.32%之間；內(nèi)標(biāo)的平均提取回收率為98.76%，符合生物學(xué)樣品的分析要求，結(jié)果見表2。

表2 單羥基卡馬西平、MHD 和內(nèi)標(biāo)提取回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

3.5.1 室溫穩(wěn)定性試驗(yàn)

取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3 種濃度的QC 樣品各5 份，測(cè)定即時(shí)血藥濃度，并在室溫條件下放置4 h 和10 h 后測(cè)定樣品血藥濃度，求得RSD 和RE 值。經(jīng)測(cè)定MHD 血漿樣品在室溫下放置10 h 后仍穩(wěn)定，RSD 均小于4.47%，RE 值在1.50%～2.98%之間，結(jié)果見表3。

表3 奧卡西平代謝產(chǎn)物單羥基卡馬西平穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 (n=5)

3.5.2 凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)

取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3 種濃度的QC 樣品各5 份，測(cè)定即時(shí)血藥濃度，并于-20 ℃冰箱中冷凍保存24 h 后室溫下解凍1 h 后測(cè)定，反復(fù)凍融3 次，求得RSD 和RE 值。經(jīng)測(cè)定MHD 血漿樣品反復(fù)凍融3 次后仍能保持穩(wěn)定，RSD 均小于2.83%，RE 值在1.86%～9.41%之間，結(jié)果見表3。

3.5.3 處理后的血漿樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器中儲(chǔ)存的穩(wěn)定性試驗(yàn)

取低、中、高3 個(gè)濃度水平的血漿QC 樣品（5、15、40 μg/ml）各5 份，測(cè)定即時(shí)血藥濃度，然后放置在自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)12 h、36 h 后再次測(cè)定，求得RSD 和RE 值。經(jīng)測(cè)定處理后的MHD 血漿樣品在進(jìn)樣器內(nèi)放置36 h 仍能保持穩(wěn)定，RSD 均小于5.09%，RE 值在-1.34%～7.74%之間，結(jié)果見表3。

3.5.4 長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)

取低、中、高3 個(gè)濃度水平的血漿質(zhì)控樣品（5、15、40 μg/ml）各5 份，測(cè)定即時(shí)血藥濃度，并置于-20 ℃冰箱中凍存30 d 后取出解凍后測(cè)定，求得RSD 和RE 值。經(jīng)測(cè)定MHD 血漿樣品在-20 ℃冰箱中凍存30 d 后仍能保持穩(wěn)定，RSD 均小于4.39%，RE 值在-2.53%～3.19%之間，結(jié)果見表3。

4 討論

目前，有關(guān)MHD 的檢測(cè)方法的文獻(xiàn)很多，其中,高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法都有報(bào)道，后者雖有靈敏度高、專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，但其儀器昂貴，且需專業(yè)人員進(jìn)行操作，很難在大部分的醫(yī)療機(jī)構(gòu)普及[13-15]。另外，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中多使用固液萃取法或液液萃取法進(jìn)行血樣的前處理，但這種處理過程相對(duì)復(fù)雜、耗時(shí)，且經(jīng)濟(jì)成本較高[11,16]。本方法采用甲醇沉淀蛋白進(jìn)行血樣的前處理，建立了HPLC 法測(cè)定人血漿中MHD 血藥濃度的方法，整個(gè)過程操作簡(jiǎn)單、快速，樣品分析時(shí)間較短，適用于臨床大量樣品的連續(xù)檢測(cè)。

文獻(xiàn)報(bào)道的流動(dòng)相有乙腈-10 mmol/L 磷酸二氫鉀溶液（33∶67，V/V）[12]、水-乙腈（65∶35，V/V）[17]、水-甲醇-乙腈（64∶30∶6，V/V/V）[18]等。本方法采用了水-乙腈，按不同的配比進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)水-乙腈的比例為80∶20 時(shí)，色譜峰的峰形、出峰時(shí)間及分離度最佳。文獻(xiàn)采用卡馬西平[17]、苯巴比妥[19]和奧硝唑[20]等作為內(nèi)標(biāo)，本研究通過篩選發(fā)現(xiàn)奧硝唑的保留時(shí)間為6.1 min，不僅與MHD 的保留時(shí)間相近，又能與其有很好的分離，且其性質(zhì)穩(wěn)定，滿足內(nèi)標(biāo)的要求。

本實(shí)驗(yàn)建立的測(cè)定人血漿中OXC 活性代謝產(chǎn)物MHD 的HPLC 法，MHD 線性回歸方程中的r=0.998 6，說明血藥濃度在2～50 μg/ml 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，日內(nèi)、日間精密度RSD 均小于15%，準(zhǔn)確度在95.57%～100.59%之間，MHD及內(nèi)標(biāo)的平均提取回收率在89.62%～98.76%之間。血漿樣品的穩(wěn)定性試驗(yàn)證明，在室溫放置10 h、反復(fù)凍融、處理后放置進(jìn)樣器36 h 以及低溫保存30 d 的情況下，樣品未見明顯降解，仍能保持穩(wěn)定。本研究建立的HPLC 法操作快速簡(jiǎn)單，精密度、回收率高，穩(wěn)定性好，專屬性強(qiáng)，不受血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且靈敏度高，適用于奧卡西平臨床血藥濃度的監(jiān)測(cè)。

目前癲癇治療主要以藥物治療為主，奧卡西平是第二代抗癲癇藥物，我國(guó)諸多癲癇病專家也建議將其作為癲癇部分性發(fā)作和全面強(qiáng)直陣攣發(fā)作的首選藥物[21]。但奧卡西平使用過程中可能出現(xiàn)瘙癢、蕁麻疹、血管性水腫等超敏反應(yīng)，包括Stevens Johnson 綜合征中毒性表皮壞死松解癥[22]等，還可引起低鈉血癥、頭暈、胃腸道不適等不良反應(yīng)，有文獻(xiàn)報(bào)道，其療效及不良反應(yīng)可能與血藥濃度密切相關(guān)[23]，因此開展奧卡西平血藥濃度的測(cè)定，能提高藥物治療的療效，同時(shí)可以有效避免或減少可能產(chǎn)生的藥物不良反應(yīng)，提高癲癇患者服藥的依從性。本研究建立了測(cè)定人血漿中MHD 血藥濃度的方法，應(yīng)用于臨床，為臨床個(gè)體化給藥提供依據(jù)，值得臨床推廣使用。