煙酰胺單核苷酸對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用

張賽龍，凌期盛，楊 政，繆朝玉 （. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海 00433；. 煙臺大學(xué)藥學(xué)院，山東煙臺 64005）

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）是真核細(xì)胞中的一種重要的代謝氧化還原輔酶，它在各種生物過程中起關(guān)鍵作用，包括新陳代謝、衰老、細(xì)胞死亡、DNA 修復(fù)和表達(dá)[1-2]。NAD 主要有3 種生物合成途徑，在哺乳動物中，補(bǔ)救途徑是NAD 的主要來源并且該途徑只有兩個步驟（圖1）。NAD 在該途徑中的合成速率主要由煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（Nampt）決定，該步驟首先將煙酰胺（NAM）和5-磷酸核糖基-1-焦磷酸（PRPP）轉(zhuǎn)化為煙酰胺單核苷酸（NMN）。然后，在第二步中將NMN 與ATP 偶聯(lián)并轉(zhuǎn)化為NAD[3]。直接使用NMN 可以彌補(bǔ)NAD 的不足，因此NMN 可以參與多種疾病的調(diào)節(jié)，如2 型糖尿病、肥胖癥、心力衰竭、神經(jīng)再生和炎癥等[4-8]。

潰瘍性結(jié)腸炎是炎癥性腸病的一種。近年來，其病因和發(fā)病機(jī)制的研究受到廣泛關(guān)注[9-11]。目前治療潰瘍性結(jié)腸炎的手段主要是對癥治療，如抗感染藥、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等，但這些藥物長期使用會帶來很多不良反應(yīng)[12-13]。NAD 與多種炎癥性疾病有關(guān)，如敗血癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[14-15]。此外，有報道顯示，炎癥性腸病患者結(jié)腸組織和血清中Nampt 濃度升高，并將Nampt 作為小兒炎癥性腸病嚴(yán)重程度的標(biāo)志物[16-17]。因此，作為NAD合成的中間重要產(chǎn)物NMN，也有可能對炎癥性腸病產(chǎn)生一定作用。與此同時，目前有很多含有NMN的保健品問世，但是由于NMN 參與調(diào)節(jié)的功能非常復(fù)雜，并且有研究表明NMN 可以促進(jìn)腫瘤的增殖等作用[18]，因此，補(bǔ)充NMN 并不一定對人體都有益。并且，NMN 作為保健品需要長期服用，但對于一些患有如炎癥性腸病的慢性病患者，評價其對于患者的安全性極其重要。

本研究主要考察NMN 對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的作用。以評價NMN 作為保健品是否適用于患有潰瘍性結(jié)腸炎的患者。

圖1 哺乳動物細(xì)胞中NAD 的生物合成途徑[4-8]

1 材料與方法

1.1 DSS 誘導(dǎo)腸炎模型的制備

雄性C57 小鼠（8 周齡，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司），放于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)2 周后進(jìn)行造模。按照之前的方法進(jìn)行模型制備[19]，將DSS（美國MP 公司，分子量為36 000～50 000）溶于水中，至終濃度為3%，讓小鼠自由飲用。

1.2 分組及給藥情況

將NMN[音芙醫(yī)藥科技（上海）有限公司]溶于生理鹽水中，制備不同濃度的NMN 溶液，將雄性C57 小鼠分為6 組，分別為生理鹽水對照組，3、10、30、100、300 mg/kg NMN 的不同劑量組。按照容積0.1 ml/10 g，通過灌胃（ig）和腹腔注射（ip）兩種方式，從第1 天開始給藥，每天1 次，直至實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)束。

1.3 疾病評分（DAI）

按照之前的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分[19]，對體重下降程度、大便性狀、血便情況分別進(jìn)行評分，而后進(jìn)行加和，計算總分?jǐn)?shù)。具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 疾病評分

1.4 形態(tài)學(xué)檢測及組織學(xué)染色

小鼠處死后，取整個結(jié)腸部位，測量長度進(jìn)行比較。而后將結(jié)腸下段部位組織用4%多聚甲醛固定24 h，然后包埋在石蠟中。準(zhǔn)備厚度為4 μm的切片，按照之前的實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)行HE 染色[19]。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 NMN 對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠生存時間的影響

為了確定實(shí)驗(yàn)的最佳觀察時間，首先對小鼠的生存曲線進(jìn)行測定。將100 和300 mg/kg 的NMN通過灌胃的給藥方式，檢測3%DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠生存時間（圖2），在給藥第9 天時，300 mg/kg 組中有2 只小鼠死亡，生理鹽水對照組和100 mg/kg 組在第10 天出現(xiàn)小鼠死亡。第17 天時，300 mg/kg 組小鼠全部死亡，而在第20 天時，生理鹽水對照組和100 mg/kg 組全部死亡。3 組生存曲線之間并無統(tǒng)計學(xué)差異。由于在給藥第9 天時，有小鼠出現(xiàn)死亡，因此我們將后面實(shí)驗(yàn)的觀察時間設(shè)定為8 d。

圖2 NMN 對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠生存曲線的影響（每組n = 10）

2.2 NMN 不同給藥方式對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠體重和DAI 的影響

為了考察不同給藥方式對小鼠的影響，我們分別通過灌胃和腹腔注射兩種給藥方式，觀察NMN對于小鼠體重和DAI 的影響，如圖3 所示，灌胃和腹腔注射兩種給藥方式對潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠體重和DAI 分?jǐn)?shù)的影響無顯著性差異，二者都在第5 天時表現(xiàn)出體重下降并出現(xiàn)稀便情況。因此，為了更真實(shí)的模擬人用藥環(huán)境，我們在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用灌胃的給藥方式。

圖3 NMN 不同給藥方式對于DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體重和DAI 影響

2.3 NMN 對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸長度與形態(tài)的影響

為了進(jìn)一步考察不同濃度NMN 對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠的影響，我們應(yīng)用了不同濃度的NMN 通過灌胃給藥的方式，分別對小鼠的體重和DAI 進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示（圖4A、4B），不同濃度的NMN 對小鼠的體重和DAI 的影響，與對照組相比均無顯著性差異。為了更進(jìn)一步確認(rèn)，我們又對結(jié)腸長度和結(jié)腸形態(tài)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示（圖4C、4D），300 mg/kg 的NMN 與對照組相比，腸道長度和免疫組化切片結(jié)果并無顯著性差異。

3 討論

本研究測定了不同劑量的NMN 對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的體重、DAI 評分、結(jié)腸長度和腸道形態(tài)的影響，即NMN 對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠并無顯著作用。

NMN 作為NAD 的前體，其功能目前認(rèn)為是通過NAD 來體現(xiàn)的，NNM 和NAD 的代謝是緊密聯(lián)系的。NAD 在人體內(nèi)有3 條生化途徑：Preiss-Handler 途徑、從頭合成途徑和補(bǔ)救合成途徑（圖1）[20]。Preiss-Handler 途徑從NA 開始，經(jīng)過NAPRT 催化變成NAMN，經(jīng)過NMNAT 的催化，變成NAAD，然后再被NAD 合成酶NADS 催化成NAD[21]。從頭合成途徑首先是從食物中攝取的色氨酸開始，經(jīng)過一系列體內(nèi)生化反應(yīng)生成喹啉酸（QA），而后經(jīng)過（QPRT 催化生成NAMN 進(jìn)入Preiss-Handler 途徑[22]。補(bǔ)救合成途徑從NAM 開始，然后經(jīng)過NAMPT催化后，變成NMN，NMN 同樣通過NMNAT 酶的催化轉(zhuǎn)變成NAD，而后NAD 在經(jīng)過3 個消耗途徑NAD 依賴的去乙?；福⊿irtuins）、多聚ADP核糖聚合酶（PARPs）、環(huán)腺苷二磷酸核糖（cADPR）合酶后變成煙酰胺完成循環(huán)[2]。NAD 的含量在這3 條途徑下保持平衡，補(bǔ)救合成途徑是人體NAD的主要來源，該過程中的NAMPT 是這個循環(huán)的限制步驟[23]。

NMN 作為NAD 合成的重要中間產(chǎn)物，存在于多種類型的細(xì)胞中，并參與了不同的生物學(xué)過程。NMN 可防止由NAD 分解代謝酶而引起的NAD 耗竭。目前報道的NMN 大部分作用對人體都是有益的，但是隨著研究的深入，NAD 的增加也能夠加重某些疾病的發(fā)展，如炎癥和腫瘤[18,24-25]。近期有研究表明，在克羅恩結(jié)腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎患者的結(jié)腸組織中，血漿Nampt 和mRNA 水平均顯著升高[16]。更有研究表明，Nampt 的特異性抑制劑FK866，改善了DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠癥狀，并抑制了小鼠中與炎癥相關(guān)的腫瘤發(fā)生。由于Nampt 是NMN 的重要合成生物酶，因此,我們懷疑NMN 可能也會加重DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠癥狀?；诖?，我們首先檢測了不同劑量的NMN 對模型小鼠的生存曲線的影響，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，NMN 并不會顯著改變模型小鼠的生存時間。而后我們發(fā)現(xiàn)不同給藥方式也不能顯著改變小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的狀態(tài)。最后我們又檢測不同濃度的NMN 對于腸炎小鼠的影響，發(fā)現(xiàn)300 mg/kg 劑量以下的NMN，對于模型小鼠的體重、DAI 評分、結(jié)腸組織均不能引起顯著性改變。因此，NMN 對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠并無影響。

圖4 不同濃度的NMN 對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠的作用

綜上，NMN 具有廣泛的人體生物調(diào)節(jié)作用，目前市面上出現(xiàn)了很多含有NMN 的保健品。雖然我們的研究結(jié)果表明NMN 對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠無明顯毒副作用，但是對于NMN 的副作用仍需繼續(xù)考察，特別是對于長期使用NMN 的人群來說，充分考察其安全性尤為重要。